パルヴォウイルスを使った染色体における特異的遺伝子の組換え技術の開発

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ヒトパルヴォウイルスB19ゲノム由来の単鎖DNAベクターの構築とそれを用いた染色体上での遺伝子組換えを計画した。まず最初に、ヒト培養細胞核内で安定に自律増殖可能なベクターを構築する目的で、B19ゲノムの両端に存在するパリンドローム構造領域のサブクローニングを試みた。Dr.J.D.Tratschin(Institut fur Viruskrankheiten und Immunoprophylaxe,Switzerland)より供与されたB19ゲノムDNAクローンpVD1,2,8,10(Tratschin,et al.Virology 175,247-254,1990)を鋳型としてPCR(polymerase chain reaction)法によりパリンドローム構造領域の増幅を行った。しかし、増幅されたDNAには、塩基配列から推定される大きさの分子は検出できなかった。そこで、パリンドローム構造内に存在するいくつかの制限酵素部位を利用して複数の断片に分断後、サブクローニングすることにした。しかし、pVD1,2,8,10のDNAは、塩基配列から存在すると考えられる制限酵素で切断されず、パリンドローム構造の大部分に欠失変異が認められた。今後は、欠失領域部分を合成オリゴヌクレオチドによって補い、完全なパリンドロームを再構成してベクターの構築しようと考えている。また、一般に使用されている大腸菌では、完全なパリンドロームを安定に維持できない可能性もあるので、SURE株の使用等も検討したい。