ヒト細胞核内で自律増殖するヒトパルヴォウイルスベクターの作製と染色体治療への応用

在人类细胞核中自主增殖的人类细小病毒载体的制备及其在染色体治疗中的应用

• 批准号: 08770091
• 负责人: 橋中 一也
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: 宮崎医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770091/
• 关键词: 遺伝子組換え; 染色体; パルヴォウイルス

パルヴォウイルスのパリンドローム構造は、完全鎖長の状態では不安定であるためcDNAクローンからサブクローニングすることが困難であった。そこで、パリンドローム構造領域のみをオリゴヌクレオチドから合成することにした。ヒト・パルヴォウイルスB19ゲノムのパリンドローム構造およびその周辺の塩基配列を基にして20個のオリゴヌクレオチドを合成し、5'末端および3'末端パリンドローム構造とマルチクローニングサイトを持つDNA断片を調製した。このDNA断片をM13ファージ複製開始点を持つプラスミドに挿入した。構築したプラスミドは、M13ヘルパーファージを使って単鎖DNAにし、5'末端および3'末端部分に結合する合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて制限酵素MscIで切断した場合に、細胞内で自律増殖可能と考えられるパルヴォウイルスゲノム様の単鎖DNA断片が分離できるように設計した。パリンドローム構造は不安定であるため構築したプラスミドの宿主大腸菌には突然変異が起こりにくいSURE-2株を用いた。実際にパルヴォウイルスベクターをヒト培養細胞へ導入する場合、DNA断片の複製効率や安定性などの点から単鎖DNAが良いか二本鎖DNAが良いかの問題がある。この問題を解決する目的で構築したプラスミドにSV40プロモーターにより発現可能なホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を挿入した。現在、このプラスミドとHeLa細胞を使って、ヒト培養細胞への導入効率と細胞内での自律増殖能および安定性の解析を行なっている。

The structure of the パルヴォウイルスのパリンドローム is completely locked and the state is unstable.あるためcDNAクローンからサブクローニングすることがdifficultyであった.そこで, パリンドロームConstruction field のみをオリゴヌクレオチドから synthesized することにした. Structureおよびそのweek躺の塩组arrayをbasedにして20piecesのオリゴヌクレSynthesis of オチドを, 5' terminal および 3' terminal パリンドローム structure とマルチクローニングサイトをhold つDNA fragment を modulation した.このDNA fragmentをM13ファージreplication start pointをholdつプラスミドにinsertした. Construct the したプラスミドは, M13 ヘルパーファージをmake the って単DNA lockにし, 5 'Terminator 3' The terminal part is combined with the する to synthesize the オリゴヌクレオチドをハイブリダイIt is possible to cut off the restriction enzyme MscI under certain conditions and to consider the possibility of autonomous growth in cells.れるパルヴォウイルスゲノム様の単DNA Fragment Separation できるようにDesign した.パリンドロームstructure は unstable であるためconstruct したプラスミドのstay The main coliform strain has suddenly changed and the SURE-2 strain has been used. Where the cultured cells of the 実记にパルヴォウイルスベクターをヒト cultured cells are introduced and the DNA fragments are copied Efficiency and stability are the key points of the DNA's good properties. The problem is solved, the purpose is built, and the problem is solved SV40 プロモーターにより発appearsなホタル・ルシフェラーゼ伝子をINSERT した. Now, the introduction efficiency of HeLa cells using HeLa cells, the efficiency of introduction into cultured cells, and the self-regulation of intracellular proliferation and stability are analyzed and analyzed now.