シトクロームb558大サブユニット遺伝子の転写調節機構の解析

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1.オリゴ・キャップ置換法によるシトクロームb558大サブユニット遺伝子転写開始点の確定。健常人より単離した顆粒球及び単核球より得られたポリ(A)^+mRNAを用いてオリゴ・キャップ置換法にて完全鎖長のシトクロームb558大サブユニットmRNAの5'末端をクローニングしその塩基配列より、(1)これまでに提唱されてきたシトクロームb558大サブユニット遺伝子の転写開始点はプライマーエクステンション法のみによって決定されたものであり確定的ではなかったが、本研究によりその位置も確かに転写開始点である事を明らかにした。(2)上記の位置よりさらに5'上流に存在する少なくとも6ヶ所の新たな転写開始点を確定し、本遺伝子が単一の転写開始点を有する通常のTATAボックス型遺伝子ではない事を初めて示した。(3)研究で得られた転写開始点が先に得られたRNaseプロテクションアッセイの結果と一致している事から、RNaseプロテクションアッセイのみでは推定の域を越えなかった各転写開始点の使用頻度の差や細胞種差が明確となった。2.シトクロームb558大サブユニット遺伝子のプロモーター領域の単離と遺伝子発現調節部位の解析。上記の結果によりシトクロームb558大サブユニット遺伝子のプロモーター領域は翻訳開始点の十数塩基上流から始まっている事が明らかとなったので、翻訳開始点から5'上流約5キロベースの範囲でさまざま欠失を持つミュータント遺伝子を作成した。そして、それらの転写調節活性を前骨髄性白血病細胞(HL60)を用いて解析し、現在までのところ転写促進に必要であると考えられる部位を1カ所同定した。