ホスファチジルイノシトール・グリカンの糖鎖構造解析

1.亜硝酸脱アミノ化とピリジルアミノ化の反応条件を設定するために、グルコサミンを用いて至適条件を検討した。50mM亜硝酸溶液中で25℃、16時間亜硝酸脱アミノ化し、次いで蒸発乾固の後、定法よりも穏和な条件でピリジルアミノ化を行い、40%の収率でグルコサミンから2,5‐アンヒドロマンノースを得る系を確立した。2.ラット肝臓より、溶媒抽出によって脂質画分を調製し、前述の方法に従って亜硝酸による脱アミノ化を行い、目的のホスファチジルイノシトール・グリカン(PIG)から糖鎖部分を分離した。分離したオリゴ糖をピリジルアミノ化によって蛍光標識し、ゲル濾過によって過剰の試薬を除去した。こうしてクル-ドなPIG糖鎖画分を得た。還元末端糖分析の結果、ゲル濾過カラム体積の約100%に相当する部分に、2,5‐アンヒドロマンノースを還元末端にもつオリゴ糖が検出された。このオリゴ糖を精製するために、まずサイズが分画HPLCで展開したところ目的の糖鎖は3.1グルコース単位の位置に溶出されてきた。さらに精製を進めるために、逆相HPLCに供したところ、単一ピークにまで精製することができた。3.得られたPIG由来ピリジルアミノ化オリゴ糖の構造解析を行った。酸加水分解して還元末端糖分析を行ったところ、2,5‐アンヒドロマンノースが検出されたので、脱アミノ化前の還元末端は、グルコサミンだと推定された。さらに糖水解酵素消化と糖組成分析を行い、糖鎖構造解析を行った。

1.亜硝酸脱アミノ化とピリジルアミノ化の反応条件を設定するために、グルコサミンを用いて至適条件を検討した。50mM亜硝酸溶液中で25℃、16時間亜硝酸脱アミノ化し、次いで蒸発乾固の後、定法よりも穏和な条件でピリジルアミノ化を行い、40%の収率でグルコサミンから2,5‐アンヒドロマンノースを得る系を確立した。2.ラット肝臓より、溶媒抽出によって脂質画分を調製し、前述の方法に従って亜硝酸による脱アミノ化を行い、目的のホスファチジルイノシトール・グリカン(PIG)から糖鎖部分を分離した。分離したオリゴ糖をピリジルアミノ化によって蛍光標識し、ゲル濾過によって過剰の試薬を除去した。こうしてクル-ドなPIG糖鎖画分を得た。還元末端糖分析の結果、ゲル濾過カラム体積の約100%に相当する部分に、2,5‐アンヒドロマンノースを還元末端にもつオリゴ糖が検出された。このオリゴ糖を精製するために、まずサイズが分画HPLCで展開したところ目的の糖鎖は3.1グルコース単位の位置に溶出されてきた。さらに精製を進めるために、逆相HPLCに供したところ、単一ピークにまで精製することができた。3.得られたPIG由来ピリジルアミノ化オリゴ糖の構造解析を行った。酸加水分解して還元末端糖分析を行ったところ、2,5‐アンヒドロマンノースが検出されたので、脱アミノ化前の還元末端は、グルコサミンだと推定された。さらに糖水解酵素消化と糖組成分析を行い、糖鎖構造解析を行った。