膀胱平滑筋細胞の収縮制御機構の解明に関する研究

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1.家兎膀胱平滑筋細胞を用いてムスカリン受容体のサブタイプによる膀胱平滑筋収縮機構について検討した。2.SDラットの膀胱を摘出して粘膜除去後、平滑筋組織を細切し0.03%コラゲナーゼを含むPBSにて平滑筋細胞を遊離させ、これをMEM培地(10%FBS,100U/mlペニシリン,100μg/mlストレプトマイシン添加)に移しCO_2インキュベータ-(本予算で購入)内で37℃、10%CO_2環境下で培養した。固着細胞を0.05%トリプシンで処理し、継代培養して3-4代後に実験に使用した。細胞のviabilityはtrypan blueにより、平滑筋細胞の同定は平滑筋αアクチンにたいするモノクローナル抗体を用いてimmunoblotting法にて行った。膀胱平滑筋細胞の収縮反応は250μl細胞浮遊液に250μlの薬剤(KCl,acetylcholine)を含んだ溶液を加えて攪拌し、60秒間incubationして25%glutaraldehydeを加えて反応を停止させて、倒立顕微鏡にて細胞長の変化を観察した。ムスカリン受容体のサブタイプのantagonists(pirenzepine(M1),methoctoramine(M2),4-DAMP(M3))は約15分間前処置してacetylcholineによる収縮反応の変化を観察した。3.この方法により得られた細胞のviabilityは約75%であり、ほとんどすべての細胞に平滑筋αアクチンが検出され、平滑筋細胞であることが同定された。KClおよびacetylcholineにより平滑筋細胞は用量依存生に収縮反応を示し、最大収縮率はともに約30%であった。ムスカリン受容体のサブタイプのantagonistの前処置はいずれも用量依存生にacetylcholineによる収縮を抑制したが、そのpA_2値によるそれぞれの薬剤の作用強度は4-DAMP>>methoctoramine≧pirenzepineの順であった。4.以上の結果より家兎膀胱平滑筋細胞にはいずれのムスカリン受容体のサブタイプも存在するが、その収縮に関係するサブタイプはM3であることが確認された。またこの細胞単離法は簡便であり、今後単一細胞を用いての細胞内情報伝達機構などの解明に有用であることが示唆された。