若年性歯周炎原因菌のエネルギー産生機構の分子生物学的研究 Actinobacillus actinomycetemcomitansの呼吸鎖成分を中心として

幼年牙周炎细菌能量产生机制的分子生物学研究 聚焦伴放线放线杆菌呼吸链组分

• 批准号: 08672100
• 负责人: 古西 清司
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The Nippon Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672100/
• 关键词: 若年性歯周炎; エネルギー産生機構; 呼吸鎖; Actinobacillus actinomycetemcomitans

若年性歯周炎原因菌のActinobacillus actinomycetemcomitansは通性嫌気性菌で,酸素のある環境においても生育可能である。本研究では酸素を利用するエネルギー産生系の役割を分子生物学的に解明することを目標とするが,まず果糖を炭素源として培地に添加したところNADH-酸素酸化還元酵素活性が誘導されたので,そのうち電子伝達反応の初発酵素であるNADH脱水素酵素の精製を行った。本菌ATCC29522株を果糖添加培地で培養し対数増殖期で集菌後超音波膜小胞を調製し,これよりNADH脱水素酵素をNADH-ユビキノン-1(Q1)酸化還元酵素活性を指標として精製した。まず膜小胞からの可溶化は0.5%sucrose monolaurate(界面活性剤)で行い,以降同界面活性剤存在下精製を進めた。DEAE-Sephacelカラムで分離した後DEAE-Sephacelに再クロマトグラフィを行い,HiTrapBlueカラム,最後にTSK-GEL G3000SWXLカラム(HPLC)によって完全精製した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動より求めた単量体の分子量は47Kであり,ゲルろ過より求めた未変性酵素の分子量は140Kであった。このことより本酵素はnativeな状態では3量体で存在していることが示唆された。精製した脱水素酵素には非ヘム鉄の存在は認められず,またキノン類も含まれていなかった。本酵素は電子受容体としてQ1,メナジオン,2,6-dichloroindophenol,フェリシアン化カリウム,チトクロムcを,また電子供与体としてはNADHを利用することができた。NADPHは電子供与体とはならなかった。ミトコンドリアのcomplex Iの特異的な阻害剤であるロテノンやHQNO,カプサイシンによっては阻害されなかった。これらの性質より本菌に含まれるNADH脱水素酵素はミトコンドリアタイプのNDH-1にではなく,バクテリアタイプのNDH-2に含まれることが明らかとなった。現在本酵素のアミノ酸の一次配列を決定中であるが,今後その情報をもとに本酵素の遺伝子のクローニングを計画している。

Actinobacillus actinomycetemcomitans, the causative agent of periodontitis, is not compatible with the sex of the bacteria, and the acid and the environment may cause fertility. In this study, we investigated the molecular biology of NADH dehydrogenase production system and its application in the purification of NADH dehydrogenase. The strain ATCC29522 was cultured in fructose medium. After the culture period, the cells were modulated by ultrasonic wave. The NADH dehydratase activity was measured by NADH-1 (Q1) acidifying reductase activity. The solubilization of the membrane cells is carried out by 0.5% sucrose monolayer (surfactant), and the purification is carried out in the presence of a reduced surfactant. After DEAE-Sephacel separation, DEAE-Sephacel was re-purified,HiTrapBlue separation, and finally TSK-GEL G3000SWXL separation (HPLC). SDS-P-P-P This enzyme is native to the three organisms that exist. The presence of purified dehydro enzymes in the presence of iron is not recognized. The enzyme is an electron acceptor and a donor. The enzyme uses NADH. NADPH electron donor and donor The special resistance of the complex I is very high. This strain contains NADH and NDH-1, and NDH-2. The primary sequence of the enzyme is determined, and the next sequence of the enzyme is determined.