歯周病原性細菌が産生するシステインプロテアーゼの分子遺伝学的研究

牙周病原菌产生的半胱氨酸蛋白酶的分子遗传学研究

• 批准号: 08672110
• 负责人: 小佐野 悦雄
• 金额: --
• 依托单位: Aichi Gakuin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672110/
• 关键词: 歯周病原性; 口腔細菌; Porphyromonas gingivalis; システインプロテアーゼ; hap遺伝子; 発現蛋白質; シークエンス

目的:Porphyromonas gingivalis(P.g.)は、進行性歯周炎の主な病原菌と考えられている。この菌の持つ病原因子のうち、プロテアーゼ活性を持つ血球凝集素(HA/P)は、組織破壊と付着因子という両面を持っている点が注目される。申請者らは、既にこの物質の遺伝子(hap)を約4kbのBamHI断片にクローン化し、遺伝子産物の発現を試みてきた。今回、T7ファージ由来の強力な発現システムを用いることにより、いくつかのサイズの遺伝子産物の大量発現に成功したので検討した。方法:蛋白質の発現誘導は、約4kbのBamHI断片と、この断片中のPstI-PstI間約2.7kb、PstI-SphI間約2.3kbをpT7ベクターに各々連結し、E.coliBL21(DE3)を形質転換して、IPTG存在下で行った。培養菌体を超音波破砕して全菌体抽出液、水溶性分画、不溶性分画を得た。発現蛋白質をSDS-PAGEで泳動後、PVDF膜へ転写した蛋白質のN-末端配列を分析した。結果:1)hap遺伝子に由来する蛋白質の大量発現が不溶性分画に認められた。SDS-PAGEで測定した分子量は、BamHI断片遺伝子で67kDa、PstI-PstI間は57kDa、PstI-SphI間は52kDaであった。2)発現蛋白質のN-末端アミノ酸配列を分析したところ、20残基が報告されているシステインプロテアーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列と一致した。3)発現誘導を試みる過程で、pBluescritpやpTZ18RよりpT7-5/6又はpETベクターの方が発現効率が高い事が分かった。今後、不溶性分画中の発現蛋白質を可溶化して、hap遺伝子を酵素活性を持った形で再生させる予定である。

Objective:Porphyromonas gingivalis(P.g.) The main pathogen of progressive periodontitis is detected in the middle of the tooth. The pathogenic factors of these bacteria are closely related to hemagglutinin (HA/P) activity, tissue breakdown factor and protein expression. The applicant requested a BamHI fragment of about 4 kb to be transformed into a hap fragment, and the discovery of the hap product was attempted. This time, T7 was successfully investigated for the powerful discovery of the genetic products of the virus. Methods: The expression of protein was induced by BamHI fragment of about 4kb, PstI-PstI fragment of about 2.7kb, PstI-SphI fragment of about 2.3kb, pT7-pT7 pT7-pT7-pT7 p Culture of bacteria by ultrasonic disruption, whole bacteria extract, water soluble analysis, insoluble analysis After SDS-PAGE, PVDF membrane was used to analyze the N-terminal alignment of proteins. Results:1) A large amount of protein was found in hap gene and insoluble protein was identified. SDS-PAGE determination of molecular weight, BamHI fragment 67kDa, PstI-PstI 57kDa, PstI-SphI 52kDa 2) The N-terminal amino acid sequence of the discovery protein was analyzed and the 20 residues were reported to be consistent with the amino acid sequence. 3) The occurrence rate of induction test is higher than that of pBluescritp or pTZ18R or pT7 -5/6. In the future, insoluble proteins will be solubilized, hap proteins will be regenerated, and enzyme activity will be determined.