酵母two-hybrid法によるインスリン感受性PDEキナーゼのクローニング

インスリンの抗脂肪分解作用の機序としてinsulin-sensitive phosphodiesterase(PDE)の燐酸化、活性化によるcAMPの低下が考えられている。申請者らはインスリンにより活性化されるPDEキナーゼはPI3-キナーゼの下流にありMAPキナーゼやS6キナーゼとは異なる未知のキナーゼであること、更にその上流にPDEキナーゼキナーゼが存在することを明らかにした(1)。蛋白質問相互作用を利用した酵母two-hybrid法は未知の蛋白をクローニングするのに有力な方法である。そこで本研究では酵母two-hybrid法を用い、PDE蛋白と親和性のある未知のPDEキナーゼをクローニングし、インスリンによるPDE活性化の分子機構の全容を明らかにすることを試みた。本年度はラットPDEcDNAと酵母転写囚子GAL4のDNA結合領域に融合する形で、発現ベクターを構築した。ついでスクリーニングに用いるラット肝cDNAライブラリーを発現ベクターのGAL4転写活性化領域に結合させた。レポータープラスミドを持つ酵母に、両者を同時に導入し、一次スクリーニング及び二次スクリーニングを試みているところである。もし陽性クローンが得られればライブラリー由来のcDNAの塩基配列を決定し、データベースでホモロジー検索を行う予定である。文献:1)Onuma H,Makino H,Osawa H,Suzuki Y,Taira M,Kanatsuka A,Saito Y:Mitogen-activated proteinkinase and p70 ribosomal protein S6 kinase are not involved in the insulin-dependent stimulation of cAMP phosphodiesterase kinase in rat adipocytes. Biochim Biophys Acta 1402:197-208,1998

インスリンの抗脂肪分解作用の機序としてinsulin-sensitive phosphodiesterase(PDE)の燐酸化、活性化によるcAMPの低下が考えられている。申請者らはインスリンにより活性化されるPDEキナーゼはPI3-キナーゼの下流にありMAPキナーゼやS6キナーゼとは異なる未知のキナーゼであること、更にその上流にPDEキナーゼキナーゼが存在することを明らかにした(1)。蛋白質問相互作用を利用した酵母two-hybrid法は未知の蛋白をクローニングするのに有力な方法である。そこで本研究では酵母two-hybrid法を用い、PDE蛋白と親和性のある未知のPDEキナーゼをクローニングし、インスリンによるPDE活性化の分子機構の全容を明らかにすることを試みた。本年度はラットPDEcDNAと酵母転写囚子GAL4のDNA結合領域に融合する形で、発現ベクターを構築した。ついでスクリーニングに用いるラット肝cDNAライブラリーを発現ベクターのGAL4転写活性化領域に結合させた。レポータープラスミドを持つ酵母に、両者を同時に導入し、一次スクリーニング及び二次スクリーニングを試みているところである。もし陽性クローンが得られればライブラリー由来のcDNAの塩基配列を決定し、データベースでホモロジー検索を行う予定である。文献:1)Onuma H,Makino H,Osawa H,Suzuki Y,Taira M,Kanatsuka A,Saito Y:Mitogen-activated proteinkinase and p70 ribosomal protein S6 kinase are not involved in the insulin-dependent stimulation of cAMP phosphodiesterase kinase in rat adipocytes. Biochim Biophys Acta 1402:197-208,1998