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アポトーシスを誘導する新規免疫調節物質の分子生物学的免疫抑制機序の解析

诱导细胞凋亡的新型免疫调节剂的分子生物学免疫抑制机制分析

基本信息

批准号：
10470246
负责人：
岡隆宏
金额：
$ 3.39万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

分子生物学的手法を用いてFTY720のアポトーシス誘導機序の解析を行った。アポトーシスのシグナル伝達経路の中で最も重要な以下の3つの経路について解析を行った。1) 細周期関連タンパクの活性動態に対する作用機序:FTYアポトーシスの進行に伴う細胞周期関連タンパク質の経時的活性変動を解析した。FTY720(10μM)をWR19L細胞(WR)に作用させ、経時的に回収し、関連タンパク質のmonoclonal抗体を用いてECL-Western-blottingを行った。細胞をS期に導入するE2Fの活性には変化を認めなかったが、pRbの脱リン酸化とDP-1の活性低下が認められた。一方、細胞周期制御因子(cdk-kinase)には変動を認めなかった。2) Caspases-経路に対する作用機序:FTY-apoptosisでCaspases-経路がdeath signalの主経路として働いているかどうかを解析するために、caspase-8,1,3のpeptide inhibitorsを用いてWRのアポトーシス抑制試験を行った。アポトーシスの抑制率は、細胞膜傷害は^<51>Cr-releaseで、核DNA傷害は^3H-NA releaseで測定した。核DNA傷害はいずれのinhibitorでも抑制されたが、Z-VAD-FMKは100%近い抑制率を示した。膜傷害はいずれのinhibitorによっても抑制されなかった。また、caspase-3の細胞内基質であるPARP(poly-ADP-nbose polymerase)の分解は経時的に認められた。3) 細胞骨格系に対する作用機序:FTY-apoptosisの細胞骨格系の変化としてActin-filamentの重合、脱分極とCaspases-経路との関連をFITC-phalloidinとHOECHST-33342の2重染色で解析した。FTY作用後、数分でblebbingが発生し、Actin-filamentの不連続重合を伴う核DNAの分断化が4時間以内に認められた。caspase inhibitorのDEVD-FMKを作用させると、不連続重合の解除と続いて核DNA分断化の正常化がみとめられた。以上より、FTY-apoputosisのシグナルはcaspasesを経由する経路と経由しない経路の2つのpathwaysを介してアポトーシスが完成すると考えられた。

Molecular biology approach to the analysis of FTY720's response mechanism The most important part of the network is the analysis of the following three network components. 1)The mechanism of action of cell cycle correlation:FTY correlation analysis FTY720(10μM) was used in WR19L cells (WR) to induce ECL-Western blotting in vitro. The activity of E2F was reduced during the induction phase of cells, and the activity of DP-1 was reduced during the induction phase of cells. One side, cell cycle control factor (cdk-kinase) is not changed. 2)Caspases-pathway pathway mechanism:FTY-apoptosis Caspases-pathway from death signal to main pathway, and caspase-8, 1, and 3 peptide inhibitors are used to inhibit Caspases-pathway pathway. The inhibition rate of cell membrane damage <51>and nuclear DNA damage were measured. Z-VAD-FMK has a 100% inhibition rate. The membrane damage is caused by the inhibitor. The intracellular matrix of caspase-3 and PARP(poly-ADP-nbose polymerase) are closely related to the breakdown of caspase-3. 3)Mechanism of action in cytoskeleton: Transformation of cytoskeleton in FTY-apoptosis, coincidence, depolarization, Caspases-pathway, FITC-phalloidin, HOECHST-33342, and duplex staining. After FTY treatment, blebbing occurs in a few minutes, Actin-filament disjunction occurs, and nuclear DNA fragmentation occurs within 4 hours. Caspase inhibitor DEVD-FMK function is not linked to the release of nuclear DNA fragmentation and normalization. The above, FTY-apotosis and case-based analysis of the two pathways of the circuit.