アポトーシスを誘導する新規免疫調節物質の分子生物学的免疫抑制機序の解析

分子生物学的手法を用いてFTY720のアポトーシス誘導機序の解析を行った。アポトーシスのシグナル伝達経路の中で最も重要な以下の3つの経路について解析を行った。1) 細周期関連タンパクの活性動態に対する作用機序:FTYアポトーシスの進行に伴う細胞周期関連タンパク質の経時的活性変動を解析した。FTY720(10μM)をWR19L細胞(WR)に作用させ、経時的に回収し、関連タンパク質のmonoclonal抗体を用いてECL-Western-blottingを行った。細胞をS期に導入するE2Fの活性には変化を認めなかったが、pRbの脱リン酸化とDP-1の活性低下が認められた。一方、細胞周期制御因子(cdk-kinase)には変動を認めなかった。2) Caspases-経路に対する作用機序:FTY-apoptosisでCaspases-経路がdeath signalの主経路として働いているかどうかを解析するために、caspase-8,1,3のpeptide inhibitorsを用いてWRのアポトーシス抑制試験を行った。アポトーシスの抑制率は、細胞膜傷害は^<51>Cr-releaseで、核DNA傷害は^3H-NA releaseで測定した。核DNA傷害はいずれのinhibitorでも抑制されたが、Z-VAD-FMKは100%近い抑制率を示した。膜傷害はいずれのinhibitorによっても抑制されなかった。また、caspase-3の細胞内基質であるPARP(poly-ADP-nbose polymerase)の分解は経時的に認められた。3) 細胞骨格系に対する作用機序:FTY-apoptosisの細胞骨格系の変化としてActin-filamentの重合、脱分極とCaspases-経路との関連をFITC-phalloidinとHOECHST-33342の2重染色で解析した。FTY作用後、数分でblebbingが発生し、Actin-filamentの不連続重合を伴う核DNAの分断化が4時間以内に認められた。caspase inhibitorのDEVD-FMKを作用させると、不連続重合の解除と続いて核DNA分断化の正常化がみとめられた。以上より、FTY-apoputosisのシグナルはcaspasesを経由する経路と経由しない経路の2つのpathwaysを介してアポトーシスが完成すると考えられた。

分子生物学的手法を用いてFTY720のアポトーシス誘導機序の解析を行った。アポトーシスのシグナル伝達経路の中で最も重要な以下の3つの経路について解析を行った。1) 細周期関連タンパクの活性動態に対する作用機序:FTYアポトーシスの進行に伴う細胞周期関連タンパク質の経時的活性変動を解析した。FTY720(10μM)をWR19L細胞(WR)に作用させ、経時的に回収し、関連タンパク質のmonoclonal抗体を用いてECL-Western-blottingを行った。細胞をS期に導入するE2Fの活性には変化を認めなかったが、pRbの脱リン酸化とDP-1の活性低下が認められた。一方、細胞周期制御因子(cdk-kinase)には変動を認めなかった。2) Caspases-経路に対する作用機序:FTY-apoptosisでCaspases-経路がdeath signalの主経路として働いているかどうかを解析するために、caspase-8,1,3のpeptide inhibitorsを用いてWRのアポトーシス抑制試験を行った。アポトーシスの抑制率は、細胞膜傷害は^<51>Cr-releaseで、核DNA傷害は^3H-NA releaseで測定した。核DNA傷害はいずれのinhibitorでも抑制されたが、Z-VAD-FMKは100%近い抑制率を示した。膜傷害はいずれのinhibitorによっても抑制されなかった。また、caspase-3の細胞内基質であるPARP(poly-ADP-nbose polymerase)の分解は経時的に認められた。3) 細胞骨格系に対する作用機序:FTY-apoptosisの細胞骨格系の変化としてActin-filamentの重合、脱分極とCaspases-経路との関連をFITC-phalloidinとHOECHST-33342の2重染色で解析した。FTY作用後、数分でblebbingが発生し、Actin-filamentの不連続重合を伴う核DNAの分断化が4時間以内に認められた。caspase inhibitorのDEVD-FMKを作用させると、不連続重合の解除と続いて核DNA分断化の正常化がみとめられた。以上より、FTY-apoputosisのシグナルはcaspasesを経由する経路と経由しない経路の2つのpathwaysを介してアポトーシスが完成すると考えられた。