各種微量ホルモンの時間分解蛍光免疫測定法の開発と魚類への応用

多种微量激素时间分辨荧光免疫分析方法的建立及其在鱼类中的应用

基本信息

批准号：
10876042
负责人：
山田英明
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kitasato University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度(平成12年)は、低分子ペプチドホルモンのサケ生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン(sGnRH)と神経伝達物質であるメラトニンの測定系開発を行った。両ホルモンともに、魚類の生殖腺発達や各種行動に関与していると考えられている重要なホルモンである。サケGnRHのN末端アミノ基にスペーサーを介してビオチンを導入し、これを標識抗原とした。サケGnRHに対する抗体をプレートウエルに固相化し、この抗体に対するビオチン標識抗原と測定試料の競合反応を起こさせた。固相面に形成されるビオチン標識抗原-抗体結合物を、ユーロピウム標識したストレプロアビジンで検出し、標準曲線および試料の測定値を求めた。開発された測定系は、高感度(ED=0.13ng/ml)で、その測定範囲は比較的広範囲(24pg/ml〜12.5ng/ml)であった。測定にかかわる各種項目(反応時間、反応温度、測定内・測定間変動係数)なども、おおむね以前に報告されている放射性免疫測定法とほぼ同様の結果を得た。現在、同じ方法を用いて、トリGnRH-IIとタイGnRH測定系の開発を行っている。メラトニンの測定系には、牛血清アルブミン(BSA)と結合させたメラトニン-BSA-コンジュゲートをプレートウエルに固相化する抗原固相化法を用いた。この測定系の感度は放射免疫測定法と同等で、他の測定系要因もほぼ同じであった。ニジマス受精卵を用いた実験では、明暗環境下での胚体における明瞭なメラトニン量変化を捉えることができ、その実用性が示された。同方法を用いたセロトニン測定系の開発を行っているところである。

今年（2000年），我们开发了一种用于测量小肽激素鲑鱼促性腺激素释放激素（SGNRH）和神经递质褪黑激素的系统。两种激素都是重要的激素，被认为与性腺发育和鱼类的各种行为有关。生物素通过垫片引入了鲑鱼GnRH的N末端氨基，这被用作标记的抗原。将针对鲑鱼GnRH的抗体固定在板井中，导致生物素标记的抗原与样品之间的竞争反应，以测量针对抗体。用Europium标记的树翅目和标准曲线检测到在固相表面形成的生物素标记的抗原 - 抗体结合物，并确定样品测量值。开发的测量系统高度敏感（ED = 0.13ng/ml），其测量范围相对较宽（24pg/ml至12.5ng/ml）。测量中涉及的各种项目（反应时间，反应温度，测量之间和测量之间的变异系数）与之前报道的大致相似。当前，使用相同的方法来开发甘油三酸酯GnRH-II和泰国GNRH测量系统。褪黑激素的测量系统使用了一种抗原固定方法，其中融化与牛血清白蛋白（BSA）结合的褪黑激素-BSA偶联物被固定在板块中。该测量系统的敏感性与放射免疫测定法相同，其他测量系统几乎相同。使用受精虹鳟卵的实验能够捕获光照和黑暗条件下胚胎体中褪黑激素水平的明显变化，表明其实用性。我们目前正在使用相同的方法开发5-羟色胺测量系统。