サイトカインシグナル伝達経路の可視化

我々は、細胞膜に多く局在する低分子量Gタンパク質H-Rasのシグナル伝達経路、下流のRafキナーゼ活性化の機構、シグナルの局在化機構の解明を目指している。本研究では、まず、生細胞中で、活性化されたH-RasをバルクのH-Rasと区別して1分子可視化する方法を開発した。それには、個々のH-Ras分子を可視化し、さらに、活性化しているH-Rasにだけ結合するRBD(Raf1のRas binding domain)の結合を見ることにした。このため、GFP-H-Rasを培養メラノサイトに発現させて1分子蛍光法によって可視化し、さらに、Alexaで蛍光標識したRBDを顕微注入し、YFPからAlexaへの1分子蛍光共鳴エネルギー移動(1分子FRET)を観察した。実際、リガンド刺激によって、生化学的解析でRasが活性化する事が示された時間帯に、FRETシグナルが顕著に増加した。さらに、FRETを起こしている分子は、FRETを起こしていない(あるいは刺激前の)分子に比べて運動性が1/100以下と劇的に減少し、ほとんど停止した(活性化していないH-Rasの拡散運動はリン脂質並に早い)。常時活性化型H-Ras変異体では、動いていない分子の割合が多かった。Rasの下流には増殖シグナルの他に、細胞骨格の再編成など空間的情報が重要な経路があり、Rasの運動停止にはシグナル入力の位置情報を保持する意味があると考えられる。またRasと結合してRafの活性化を阻害する分子Spredのクローニングに成功した。この分子はRafの膜移行を阻害せず、むしろRafの細胞膜からの遊離を抑制することを分子イメージングによって明らかにした。

我々は、細胞膜に多く局在する低分子量Gタンパク質H-Rasのシグナル伝達経路、下流のRafキナーゼ活性化の機構、シグナルの局在化機構の解明を目指している。本研究では、まず、生細胞中で、活性化されたH-RasをバルクのH-Rasと区別して1分子可視化する方法を開発した。それには、個々のH-Ras分子を可視化し、さらに、活性化しているH-Rasにだけ結合するRBD(Raf1のRas binding domain)の結合を見ることにした。このため、GFP-H-Rasを培養メラノサイトに発現させて1分子蛍光法によって可視化し、さらに、Alexaで蛍光標識したRBDを顕微注入し、YFPからAlexaへの1分子蛍光共鳴エネルギー移動(1分子FRET)を観察した。実際、リガンド刺激によって、生化学的解析でRasが活性化する事が示された時間帯に、FRETシグナルが顕著に増加した。さらに、FRETを起こしている分子は、FRETを起こしていない(あるいは刺激前の)分子に比べて運動性が1/100以下と劇的に減少し、ほとんど停止した(活性化していないH-Rasの拡散運動はリン脂質並に早い)。常時活性化型H-Ras変異体では、動いていない分子の割合が多かった。Rasの下流には増殖シグナルの他に、細胞骨格の再編成など空間的情報が重要な経路があり、Rasの運動停止にはシグナル入力の位置情報を保持する意味があると考えられる。またRasと結合してRafの活性化を阻害する分子Spredのクローニングに成功した。この分子はRafの膜移行を阻害せず、むしろRafの細胞膜からの遊離を抑制することを分子イメージングによって明らかにした。