Differential Display法による軟骨石灰化制御因子のクローニング

利用差异显示法克隆软骨钙化调节因子

• 批准号: 11877250
• 负责人: 松下 睦
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877250/
• 关键词: 軟骨細胞; ATDC5細胞; 石灰化; クローニング

ATDC5細胞から得たRNAを用いて3'-anchored oligo-dT primerにより逆転写反応を行った後、α-[^<35>S]dATPの存在下で3'-anchored oligo-dT primerとarbitrary primerを用いてPCR反応を行い、PCR産物を6%denaturing polyacrylamide gelに電気泳動し、autoradiographyに供した。軟骨結節形成段階にはなく石灰化段階にのみ存在しているバンドをgelから切りだし、前述と同じprimer setを用いてPCR反応を行い再増幅を行い、得られたPCR産物をprobeとし、軟骨結節形成段階および石灰化段階から抽出したRNAを用いてNorthern blot法にて遺伝子発現量に差異があるかを確認したところ、差異のあるものを5つ得られた。つぎに石灰化段階からmRNAを抽出しcDNAライブラリーを作成し、遺伝子発現に差異を認めたPCR産物のうちひとつをprobeとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを施行し、目的遺伝子の全長cDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。これはいままでに報告のない新規遺伝子であった。現在、この遺伝子の解析のため、マウスより各種臓器を摘出しRNAを抽出し、Northern blot法にて遺伝子発現部位とその発現量を比較検討しているところである。さらに今後、in situ hybridization法による発現部位の確認、遺伝子の機能解析、同遺伝子のヒトホモログのクローニングへと進めていく予定である。

ATDC5 cells obtained RNA using 3'-anchored oligo-dT primer and reversed it, and then used 3'-anchored oligo-dT primer in the presence of α-[^<35>S]dATP. Primer was used for PCR reaction, PCR product was electrophoresed in 6% denaturing polyacrylamide gel, and autoradiography was provided. Cartilage nodule formation stage stage calcification stage stage stage にのみ existence しているバンドをgel から cut りだし、the same primer mentioned above set を Use いて PCR reaction 応 を row い re-amplification を row い, get ら れ た PCR product を probe と し, cartilage nodule formation stage お よ び limeification stage か ら extract し た RNA を use い て Northern The blot method can be used to confirm the difference in the amount of the difference and the difference in the amount of the difference.つぎにThe stage of calcification からmRNA をExtracted しcDNAライブラリーをmade し、The difference of the remaining 伝子発appears をRecognition めたPCR product のうちひとつをpr obeとしてcDNAライブラリーのスクリーニングをexecutionし、objective The full-length cDNA of the remaining cDNA was determined and the base sequence was determined.これはいままでにreportのない新regulation缝子であった. Now, この伝子のanalyzingのため, マウスよりvarious kinds of urinary devices, extracting しRNA, extracting, Northern The blot method can be used to compare the actual parts of the child and the actual amount.さらに henceforth, in situ The hybridization method is used to confirm the current part of the hybridization method, analyze the function of the remaining crotch, and determine the compatibility of the same crotch.