Differential Display法による軟骨石灰化制御因子のクローニング

ATDC5細胞から得たRNAを用いて3'-anchored oligo-dT primerにより逆転写反応を行った後、α-[^<35>S]dATPの存在下で3'-anchored oligo-dT primerとarbitrary primerを用いてPCR反応を行い、PCR産物を6%denaturing polyacrylamide gelに電気泳動し、autoradiographyに供した。軟骨結節形成段階にはなく石灰化段階にのみ存在しているバンドをgelから切りだし、前述と同じprimer setを用いてPCR反応を行い再増幅を行い、得られたPCR産物をprobeとし、軟骨結節形成段階および石灰化段階から抽出したRNAを用いてNorthern blot法にて遺伝子発現量に差異があるかを確認したところ、差異のあるものを5つ得られた。つぎに石灰化段階からmRNAを抽出しcDNAライブラリーを作成し、遺伝子発現に差異を認めたPCR産物のうちひとつをprobeとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを施行し、目的遺伝子の全長cDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。これはいままでに報告のない新規遺伝子であった。現在、この遺伝子の解析のため、マウスより各種臓器を摘出しRNAを抽出し、Northern blot法にて遺伝子発現部位とその発現量を比較検討しているところである。さらに今後、in situ hybridization法による発現部位の確認、遺伝子の機能解析、同遺伝子のヒトホモログのクローニングへと進めていく予定である。

ATDC5細胞から得たRNAを用いて3'-anchored oligo-dT primerにより逆転写反応を行った後、α-[^<35>S]dATPの存在下で3'-anchored oligo-dT primerとarbitrary primerを用いてPCR反応を行い、PCR産物を6%denaturing polyacrylamide gelに電気泳動し、autoradiographyに供した。軟骨結節形成段階にはなく石灰化段階にのみ存在しているバンドをgelから切りだし、前述と同じprimer setを用いてPCR反応を行い再増幅を行い、得られたPCR産物をprobeとし、軟骨結節形成段階および石灰化段階から抽出したRNAを用いてNorthern blot法にて遺伝子発現量に差異があるかを確認したところ、差異のあるものを5つ得られた。つぎに石灰化段階からmRNAを抽出しcDNAライブラリーを作成し、遺伝子発現に差異を認めたPCR産物のうちひとつをprobeとしてcDNAライブラリーのスクリーニングを施行し、目的遺伝子の全長cDNAをクローニングし、塩基配列を決定した。これはいままでに報告のない新規遺伝子であった。現在、この遺伝子の解析のため、マウスより各種臓器を摘出しRNAを抽出し、Northern blot法にて遺伝子発現部位とその発現量を比較検討しているところである。さらに今後、in situ hybridization法による発現部位の確認、遺伝子の機能解析、同遺伝子のヒトホモログのクローニングへと進めていく予定である。