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光独立栄養細菌の遺伝子改変による新しい二酸化炭素資源化生物工学プロセスの創製

通过光自养细菌的基因改造创建二氧化碳资源利用的新生物技术工艺

基本信息

批准号：
11875170
负责人：
野澤庸則
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

光独立栄養光合成細菌の二酸化炭素固定能の向上を目指し緑色イオウ光合成細菌Chlorobiumtepidum,および紅色イオウ光合成細菌Chromatium tepidumの二酸化炭素固定に関わる酵素の同定とその機能評価を行い、遺伝子工学的改変による機能向上に向けた大腸菌を用いた発現系の構築を行った。Chlorobium tepidumの二酸化炭素固定酵素はホスホエノールピルビン酸炭酸化酵素であることをChlorobium tepidum菌体から酵素を精製することにより確認した。その後公開されたChlorobium tepidumゲノムシーケンスからも、これまでに1次構造が明らかになったホスホエノールピルビン酸炭酸化酵素と相同性の高い2745bpのORFが確認された。PCRによりこのORFを増幅し、これを発現ベクターに挿入してホスホエノールピルビン酸炭酸化酵素を発現するためのベクターpPEPCを得た。pPEPCで大腸菌BL21を形質転換し、LB培地で培養後、IPTGで発現誘導を行った。SDS-PAGEおよびC末端に付けたヒスチジンタグを利用したウエスタンブロッティングによりホスホエノールピルビン酸炭酸化酵素の発現を確認した。発現産物は不溶性顆粒となったため、6M塩酸グアニジンに可溶化後、ヒスチジンタグを利用したアフィニティーカラムで生成後、巻き戻し操作を行い、二次構造の形成を円偏光二色性、蛍光測定により確認した。巻き戻しにより可溶化されたホスホエノールピルビン酸炭酸化酵素は核磁気共鳴スペクトルの測定により活性を示すことが確認された。紅色光合成細菌で二酸化炭素の固定反応を行っているルビスコについては酵素活性を核磁気共鳴法により解析する手法を開発するとともに、酵素の巻き戻し過程を検討し、最適条件を見出すことに成功した。

Photosynthetic bacteria Chlorobium tepidum, Photosynthetic bacteria Chromatium tepidum, Chlorobium tepidium diacidifying enzyme is identified. The 2745bp ORF of the same sequence was identified as the first order structure of Chlorobium tepidum. PCR amplification of the ORF and detection of pPEPC pPEPC and E. coli BL21 were transformed, cultured and induced by IPTG. SDS-PAGE was used to confirm the enzyme production of acid acidification. After dissolution of insoluble particles, formation of secondary structure, polarization dichroism and fluorescence measurement The activity of the enzyme was determined by NMR. Red photosynthetic bacteria, enzyme activity, nuclear magnetic resonance method, method for the development of immobilized carbon, enzyme process, optimal conditions were found