好アルカリ性Bacillus属細菌細胞膜外表面付近のpHの測定

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微生物の細胞内pHを測定する方法はいくつか確立されているが、微生物細胞の細胞膜外表面付近のpHを実測する方法については知られていない。本研究では、疎水性アンカーを有するpH応答性蛍光性色素を細胞表面に結合させることによって、好アルカリ性Bacillus属細菌細胞膜の表面付近のpHを測定することを試みた。pHプローブとしては、pH応答性蛍光性色素フルオレセインと疎水性アンカーホスファチジルエタノールアミンとが共有結合したフルオレセインホスファチジルエタノールアミン(FPE)を用いた。リン脂質ベシクルにFPEを負荷する方法を確立した。ベシクルに負荷したFPEの環境pH応答性蛍光強度を測定し、ベシクル外表面付近に存在するフルオレセインの解離定数を推定した。推定された解離定数のイオン強度および2価カチオン濃度依存性をもとにして、フルオレセインがベシクル外表面から約0.6nmの距離に存在すると推定された。FPEを負荷したB.lentus C-125株細胞から調製したプロトプラストにおいても、フルオレセインは主としてプロトプラスト外表面から同様の距離に存在することが認められた。この結果から、FPEを生細胞に負荷することは可能であることが示された。しかし、FPEのflip-flop移動によって、一部のフルオレセイン残基がプロトプラスト内部へと配向されている可能性が示された。このため、FPEをプローブとして用いた際にフルオレセインの蛍光強度から推定されるのは、細胞内外のpHに関する情報が合されたものとなる。flip-flop移動しないpHプローブを開発探索して用いることによって、本研究の目的が達成されることが示された。