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表面プラズモン共鳴を用いた抗イオンチャネル抗体の測定法の開発

开发使用表面等离振子共振测量抗离子通道抗体的方法

基本信息

批准号：
11877107
负责人：
有村公良
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

表面プラズモン共鳴法(SPR)を用いてKチャネルに対する抗体および抗アセチルコリン受容体抗体の測定を試み,SPR法の有用性が確認された。(1)抗Kチャネル抗体α-dendrotoxinを用いた二重免疫沈降法およびpatch clamp法にて抗Kチャネル抗体が陽性であった2例のIsaacs症候群患者血清が,voltage-gated K channelのどの部位を認識するかについてSPR法を用いて検討した。VGKC(kv1.6)のc-DNAより3つの細胞外ドメイン(S1-S2,S3-4,S5-S6)にあたるDNA配列をサブクローニングし,GST蛋白と融合するようにベクターに挿入,大腸菌にtransfectし蛋白発現をIPTGにて誘導した。得られた各細胞外ドメイン蛋白はgluthation sepharoseカラムにて生成し,イムノブロットで抗GSTにて蛋白の発現を確認した後,SPR法に用いた。その結果,1例において,ドメインS1-S2のみが濃度依存性に患者IgGと反応し有意な共鳴角の変化を認めた。その他のドメインや健常者IgGを用いた場合には有意な変化は認められなかった。同リコンビナント蛋白を用いたイムノブロットでは通常の方法では反応は認められず,先にリコンビナント蛋白と患者血清を反応させた後protein Gで回収し,抗GST抗体で反応させてようやく目的の位置にバンドを認めた。このイムノブロット法に比較し,SPR法は簡便であり,しかも抗原蛋白の量が著しく少量で済むという利点があった。またこのようなイオンチャネルに対する抗体の場合,抗原性はチャネル蛋白の立体構造に依存することが多く,SPR法はこの立体構造を比較的維持して抗原抗体反応を見ることが出来るため,今後抗イオンチャネル抗体測定の重要な方法になると考えられた。(2)抗アセチルコリン受容体抗体α-bungarotoxinを用いて測定される抗AChR抗体が陰性の重症筋無力症患者で,血清中にα-bungarotoxin結合部位に対する抗体が存在し,toxinとの競合により抗体の測定が出来ない可能性を考え,toxin結合部位の合成ペプチド(α181-200)を作成し,健常者10例,抗アセチルコリン受容体抗体陽性20例,陰性20例のIgGを用いて,SPR法で検討した。しかし,いずれのIgGも合成ペプチドとの反応は見られなかった。今回の結果からはα-bungarotoxin結合部位に対する抗体は存在しないと考えられた。

The usefulness of SPR method was confirmed by the test of antibody and anti-SPR receptor antibody in the middle of SPR process. (1)Anti-K antibody α-denotoxin was detected by double immunosedimentation and patch clamp methods in 2 patients with Isaacs syndrome. VGKC (kv1.6) c-DNA sequence 3 extracellular DNA sequences (S1-S2, S3 - 4, S5-S6) are not included in the DNA sequence, GST protein fusion is not included in the DNA sequence, E. coli protein expression is induced by IPTG. After it was determined that each extracellular DMEM protein was produced by gluthation sepharose, and the discovery of the GST-resistant protein was confirmed, the SPR method was used. The results showed that in one case, the concentration dependence of S1-S2 was observed, and the change of resonance angle was observed in patients with IgG and anti-IgG. In the case of the use of IgG, it is not necessary to change the identity of the IgG. In contrast to the usual method, protein G was detected in the serum of patients, and anti-GST antibody was detected in the target site. Compared with SPR method, SPR method is simple and convenient, and the amount of antigen protein is small and beneficial. In the case of antigen-specific antibodies, antigen-specific antibodies depend on the three-dimensional structure of the protein. SPR method is an important method for determining antigen-specific antibodies. (2)Anti-AChR receptor antibody α-bungarotoxin assay In patients with severe muscle weakness who are negative for anti-AChR antibodies, the presence of antibodies to α-bungarotoxin binding sites in serum, the possibility of antibody assay for toxin-binding sites, and the synthesis of toxin-binding sites (α 181 - 200), 10 cases were normal, 20 cases were positive for anti-HCV receptor antibody, 20 cases were negative for IgG. In the middle of the day, the IgG was mixed into two groups. The results of this study showed that there was no evidence of the presence of antibodies against α-bungarotoxin binding sites.