臍帯血ファージライブラリーを応用した各種癌抗原に対するヒト抗体作製法の開発〜癌特異的抗体免疫療法への応用をめざして〜

开发利用脐带血噬菌体文库生产针对各种癌症抗原的人类抗体的方法 - 旨在应用于癌症特异性抗体免疫治疗 -

• 批准号: 11877206
• 负责人: 鈴木 正徳
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11877206/
• 关键词: ヒト抗体; 臍帯血ファージライブラリー; 免疫療法

最近の遺伝子工学界の話題として、小動物の血液から取り出したcDNAライブラリーからPCR法にて増幅させた可変領域のライブラリーを作製して、それを一本鎖抗体の形でファージに組み込んだファージライブラリーの応用があげられる。ファージライブラリーを用いたファージ提示法とは、様々なポリペプチドが繊維状ファージのコートタンパク上に融合タンパク質として提示される技術である。ランダム化した巨大な遺伝子ライブラリーから、迅速かつ効率的に目的分子に対して高い結合活性を持つ配列を選択できることから、このファージ提示法はライブラリーからの選択において実に有用である。今回は、腫瘍に対する特異性の高い抗体免疫療法に使用する、各種癌抗原に対応するヒト抗体の作製をおこなった。外界に対する免疫の少ないヒト臍帯血から、潜在的に保有されている抗体の可変領域の遺伝子ライブラリーを作製し、これを一本鎖抗体の形でファージ表面に提示して、ELISAプレートに固相化した抗原を用いてパニングを行い、抗原に強く反応するファージを選択した。この選択した可変領域の遺伝子を利用して一本鎖抗体またはFv断片の形で作製した。すなわちMUC1エピトープをELISAプレートに固相化して、ペプチドと結合していたファージを回収した。選択されたファージをLBプレートにまいて、出現するシングルコロニーに対応するファージも調製して、ELISA反応を行った。発色の強いファージに対応するファージミドベクターにSequencingを行い、可変領域の塩基配列を調べた。同時に、一本鎖抗体の遺伝子を大腸菌で分泌発現させた。分泌発現した一本鎖抗体はIMACにて精製を行い、さらにゲル濾過にて単一に分離精製をこころみた。抗His tag抗体を用いたWestern blottingにてその発現を確認した。我々の樹立した肝外胆管癌細胞株TFK-1は高頻度にMUC1を発現している。この細胞株を用いて、Flowcytometryにて抗His tag抗体で結合能を測定した。

Recent の heritage 伝 child worker community の topic と し て, small animal の blood か ら take り out し た cDNA ラ イ ブ ラ リ ー か ら PCR method に て rights of さ せ た can - field の ラ イ ブ ラ リ ー を cropping し て, そ れ を の form a lock antibody で フ ァ ー ジ に group み 込 ん だ フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー の 応 with が あ げ ら れ る. フ ァ ー ジ ラ イ ブ ラ リ ー を with い た フ ァ ー ジ prompt method と は, others 々 な ポ リ ペ プ チ ド が 繊 d shape フ ァ ー ジ の コ ー ト タ ン パ ク に on fusion タ ン パ ク qualitative と し て prompt さ れ る technology で あ る. ラ ン ダ ム change し た huge な posthumous son 伝 ラ イ ブ ラ リ ー か ら, rapid か つ sharper rate に purpose molecular に し seaborne て high い combining with active を hold つ with を sentaku で き る こ と か ら, こ の フ ァ ー ジ prompt method は ラ イ ブ ラ リ ー か ら の sentaku に お い て be useful に で あ る. This は, swollen sores に す seaborne る high specificity の い antibody immunotherapy に す る, various kinds of cancer antigen に 応 seaborne す る ヒ ト antibody の cropping を お こ な っ た. Less outside に す seaborne る immune の な い ヒ ト umbilical blood 帯 か ら, potential に retain さ れ て い の る antibody can be - field の heritage 伝 son ラ イ ブ ラ リ ー を as し, こ れ を の form a lock antibody で フ ァ ー ジ surface に prompt し て, ELISA プ レ ー ト に solid phase change し た antigen を with い て パ ニ ン グ を い, antigen に く reverse 応 す る フ ァ ー ジ を choice Youdaoplaceholder0 た. <s:1> また select 択 た た in the variable field of cultural heritage 伝 を use <s:1> て monolock antibody また また Fv fragment <s:1> shape で to fabricate た. す な わ ち (MUC1) エ ピ ト ー プ を ELISA プ レ ー ト に solid phase change し て, ペ プ チ ド と combining し て い た フ ァ ー ジ を back 収 し た. Sentaku さ れ た フ ァ ー ジ を LB プ レ ー ト に ま い て, す る シ ン グ ル コ ロ ニ ー に 応 seaborne す る フ ァ ー ジ も modulation し て, ELISA 応 を line っ た. 発 strong color の い フ ァ ー ジ に 応 seaborne す る フ ァ ー ジ ミ ド ベ ク タ ー に Sequencing を い, but - field の salt base with column を adjustable べ た. At the same time, に, a lock antibody cultural heritage 伝 offspring を escherichia coli で secretion occurs させた. Secreting and producing た lock antibody <s:1> IMACにて refining を row さらにゲ さらにゲ <s:1> filtration にて単 に に separation refining を <e:1> ろみた ろみた ろみた ろみた ろみた. The anti-his tag antibody を was confirmed by <s:1> たWestern blottingにてそ を. I 々 <s:1> established a た extrahepatic cholangiocarcinoma cell line TFK-1 々 high frequency にMUC1を occurrence of a て る る. <s:1> the を cell line を was determined by て て and Flowcytometryにて anti-his tag antibody で binding energy を to た た.