臍帯血ファージライブラリーを応用した各種癌抗原に対するヒト抗体作製法の開発〜癌特異的抗体免疫療法への応用をめざして〜

点击翻译按钮获取中文摘要

最近の遺伝子工学界の話題として、小動物の血液から取り出したcDNAライブラリーからPCR法にて増幅させた可変領域のライブラリーを作製して、それを一本鎖抗体の形でファージに組み込んだファージライブラリーの応用があげられる。ファージライブラリーを用いたファージ提示法とは、様々なポリペプチドが繊維状ファージのコートタンパク上に融合タンパク質として提示される技術である。ランダム化した巨大な遺伝子ライブラリーから、迅速かつ効率的に目的分子に対して高い結合活性を持つ配列を選択できることから、このファージ提示法はライブラリーからの選択において実に有用である。今回は、腫瘍に対する特異性の高い抗体免疫療法に使用する、各種癌抗原に対応するヒト抗体の作製をおこなった。外界に対する免疫の少ないヒト臍帯血から、潜在的に保有されている抗体の可変領域の遺伝子ライブラリーを作製し、これを一本鎖抗体の形でファージ表面に提示して、ELISAプレートに固相化した抗原を用いてパニングを行い、抗原に強く反応するファージを選択した。この選択した可変領域の遺伝子を利用して一本鎖抗体またはFv断片の形で作製した。すなわちMUC1エピトープをELISAプレートに固相化して、ペプチドと結合していたファージを回収した。選択されたファージをLBプレートにまいて、出現するシングルコロニーに対応するファージも調製して、ELISA反応を行った。発色の強いファージに対応するファージミドベクターにSequencingを行い、可変領域の塩基配列を調べた。同時に、一本鎖抗体の遺伝子を大腸菌で分泌発現させた。分泌発現した一本鎖抗体はIMACにて精製を行い、さらにゲル濾過にて単一に分離精製をこころみた。抗His tag抗体を用いたWestern blottingにてその発現を確認した。我々の樹立した肝外胆管癌細胞株TFK-1は高頻度にMUC1を発現している。この細胞株を用いて、Flowcytometryにて抗His tag抗体で結合能を測定した。