1分子計測によるRho family small GTPaseの機能解析

低分子量GTP結合蛋白質であるRhoファミリーsmall GTPaseは,Rho, Rac, Cdc42などから構成され,主にアクチン系の細胞骨格を介して,細胞の形態や細胞間接着など様々な細胞機能を制御する.よってRhoファミリー分子の「局所的な」活性化の検出を可能にすることは,細胞生物学における重要課題の1つであると考えられていた。申請者は,細胞内1分子計測技術を利用し,「蛍光ラベルしたGTP」と,「Rhoファミリー分子と蛍光蛋白質との融合蛋白質(Rho::GFP)」との間で発生する蛍光エネルギー移動を細胞内で検出することによって,上記の局所的な活性化の可視化を実現した。まずin vitroにおいて,GFP融合Rho GTPases(RhoA, Rac1,そしてCdc42)と蛍光標識GTPとの間でFRETが生ずることを見出し,このFRETがRho GTPasesの活性化を反映していることを,GTPによる競合阻害実験,そして結合実験などにより確認した。YFP融合Rho GTPaseを発現させた培養細胞に,蛍光標識GTを導入し,細胞外刺激を加えたところ,細胞内局所的にFRETの蛍光が観察された。例えば基底膜近傍のGFP-RhoAの場合,LPA受容体刺激後30秒以内から,接着斑と考えられる領域で活性化が進行した。Rac/Cdc42は伸長する神経突起様構造の先端部で活性化が進行し,突起の形態形成と密接な関係があることを見出した。膜蛋白質CD44の切断は,癌細胞の浸潤転移を密接な関与が推定されているが,この切断をRac1の局所的な活性化が制御していることを上記の可視化法で示した。

低分子量GTP結合蛋白質であるRhoファミリーsmall GTPaseは,Rho, Rac, Cdc42などから構成され,主にアクチン系の細胞骨格を介して,細胞の形態や細胞間接着など様々な細胞機能を制御する.よってRhoファミリー分子の「局所的な」活性化の検出を可能にすることは,細胞生物学における重要課題の1つであると考えられていた。申請者は,細胞内1分子計測技術を利用し,「蛍光ラベルしたGTP」と,「Rhoファミリー分子と蛍光蛋白質との融合蛋白質(Rho::GFP)」との間で発生する蛍光エネルギー移動を細胞内で検出することによって,上記の局所的な活性化の可視化を実現した。まずin vitroにおいて,GFP融合Rho GTPases(RhoA, Rac1,そしてCdc42)と蛍光標識GTPとの間でFRETが生ずることを見出し,このFRETがRho GTPasesの活性化を反映していることを,GTPによる競合阻害実験,そして結合実験などにより確認した。YFP融合Rho GTPaseを発現させた培養細胞に,蛍光標識GTを導入し,細胞外刺激を加えたところ,細胞内局所的にFRETの蛍光が観察された。例えば基底膜近傍のGFP-RhoAの場合,LPA受容体刺激後30秒以内から,接着斑と考えられる領域で活性化が進行した。Rac/Cdc42は伸長する神経突起様構造の先端部で活性化が進行し,突起の形態形成と密接な関係があることを見出した。膜蛋白質CD44の切断は,癌細胞の浸潤転移を密接な関与が推定されているが,この切断をRac1の局所的な活性化が制御していることを上記の可視化法で示した。