機能探索分子を用いた、容量依存性Ca^<2+>流入におけるIP_3受容体の機能解明

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IP_3の1位のリン酸にクロモフォアであるマラカイトグリーンを結合させたMGIP_3がCALI用プローブとして有効に機能する事をモルモットの平滑筋組織を用いて確認した。さらにこの方法を細胞系へと応用した。細胞にはDT40(chicken B cell)を用いた。IP_3受容体の活性を測定後、MGIP_3を加え、レーザーを照射した。処理後にもう一度IP_3受容体活性測定し、処理前と比較したところ、レーザーを照射した細胞においてのみ有意に活性が減少していた。同視野内のレーザーのあたっていない細胞ではこうした抑制は見られなかった。続いて、ラット副腎褐色細胞腫(PC12細胞)を用いて単一細胞内局所におけるIP_3受容体不活性化を試みた。PC12細胞を神経成長因子により分化誘導後、ガラスピペットを用いてMGIP_3を細胞内に添加した。そして細胞体から細胞突起によって隔てられた成長円錐にのみレーザーを照射した後、IP_3受容体活性を調べる為に、細胞外液にブラジキンを添加した。その際の細胞体と成長円錐におけるカルシウムシグナルをFura-2によるイメージングにより解析した。その結果、レーザーを照射した成長円錐でのブラジキン応答が、レーザー非照射の場合に比べて、有意に低下することが確認された。MGIP_3非添加で同様の実験を行った場合は、レーザー照射に伴う変化は見られなかった。以上の結果から、単一細胞内局所におけるIP_3受容体不活性化が達成された。今後は、この系を用いて容量依存性Ca^<2+>流入におけるIP_3受容体の機能解明する予定である。