トランスジェニックメダカを用いた魚類の温度適応分子機構に関する研究

转基因青鳉鱼温度适应分子机制研究

• 批准号: 00J09732
• 负责人: 二瓶 義明
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J09732/
• 关键词: メダカ; 骨格筋ミオシン重鎖; 温度適応; ゲノム構造解析; レポータープラスミドの構築

広温域性のコイは季節的な環境水温に馴化し、ATPase活性の異なる骨格筋ミオシン重鎖アイソフォームを発現することが明らかとなっている。しかしながら、これらミオシン重鎖アイソフォーム遺伝子の発現調節機構は未だ不明である。一方、同じく広温域性であるメダカではトランスジェニック技術が確立されており、魚類の遺伝子解析には格好の対象と考えられる。そこで本研究では、これまでに近交系メダカHNIを用いて馴化温度依存的に発現する7種類のミオシン重鎖アイソフォームcDNAをクローン化し、さらにメダカBACゲノムライブラリーよりダンデムに配列した11種類の成体速筋型ミオシン重鎖遺伝子を単離した。これらのうち1種類は新規機能遺伝子、3種類は偽遺伝子であることが示唆された。今年度は、11種類のミオシン重鎖遺伝子の発現状況を調べるとともに、各発現遺伝子の転写開始点付近の詳細な解析を行い、レポータープラスミドの構築を試みた。新規および偽遺伝子と推定されたミオシン重鎖遺伝子に特異的なプライマーを作製し、10℃および30℃馴化メダカ骨格筋から構築したcDNAライブラリーを対象にPCRを行った。その結果、新規機能遺伝子の転写産物は確認されたが、3種類の推定偽遺伝子については転写産物が得られなかった。次に5'RACEおよびRT-PCRを行い、これまでの結果とあわせて8種類のミオシン重鎖遺伝子のゲノム構造を決定した。いずれも41個のエキソンからなり、全長は約10.4〜12.0kbp、1,935〜1,939アミノ酸をコードしていた。次に、5'上流域の機能解析を行うため、これら8種類のミオシン重鎖遺伝子のうち10℃および30℃馴化メダカにおいてそれぞれ主成分として発現していたmMyHC-6およびmMyHC-7を用い、これらの5'側を欠失させた種々の長さのDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポーターアッセイ用プラスミドを構築した。すなわち、転写開始点より約2kb、1kb、500b、200bおよび20b上流域のDNA断片をルシフェラーゼ遺伝子の上流に挿入した。また、ルシフェラーゼ活性の値を標準化するため、メダカ・βアクチンのプロモーターを組み込んだプラスミドも構築した。現在、各レポータープラスミドを10℃および30℃馴化メダカの骨格筋に注入し、その後5、10および15日目のルシフェラーゼ活性を測定中である。

Temperature domain, seasonal environmental water temperature, acclimation, and ATPase activity. Bone grid tendon ミオシン重 lock アイソフォームを発appears することが明らかとなっている.しかしながら、これらミオシン重 lock アイソフォーム伝子の発Now the adjustment mechanism is unknown である. One side, same as the temperature domain temperature domain technology. Establish the analysis of the fish's remaining parts and the fish's characteristics. In this study, the そこででは and これまでに inbred lines メダカHNIを were used to acclimate the temperature with いてDegree-dependent に発成する7 kinds of のミオシン重 lock アイソフォームcDNAをクローン化し、さらにメダカBACゲノムライブラリーよりダンデThe ムに arrangement is made up of 11 types of adult quick-strengthening type ミオシン Heavy-locked 伝子を単里した.これらのうち 1 type of new regulation function 缝子, 3 types of false 缝子 であることが说憆された. This year's 11 types of のミオシン重 lock 缝子の発appearance status をadjusted べるとともに、each 発発appearance伝子の転Start by writing "near detailed analysis" and "レポータープラスミドのconstruction". New regulations of the fake legacy されたミオシン Heavy locking legacy 伝子にSpecial なプライマーを productionし, 10℃および30℃ domesticated メダカbone grid からconstructed したcDNAライブラリーを対Elephant にPCRを行った.その results, new functional legacy products, confirmed products, and 3 types of presumed pseudo-heritage products, られなかった. Time に5'RACE およびRT-PCRを行い, これまでのRESULTS とあわせて8 kinds のミオシン Heavy lock 伝子のゲノムstructure をdetermination した.いずれも41のエキソンからなり, the full length is about 10.4~12.0kbp, 1,935~1,939アミノ acid をコードしていた. Functional analysis of the upper basin of the second 5' line うため, これら8 kinds of のミオシン Heavy lock left 伝子のうち1 0℃および30℃ domesticatedメダカにおいてそれぞれMain ingredientとして発成していたmMyHC-6およびmMyHC-7 is used, これらの5' side is missing and the DNA fragment is long.ルシフェラーゼ伝子の上に组み込んだレポーターアッセイ用プラスミドをconstructedした.すなわち, 転WRITE starting point よりabout 2kb, 1kb, 500b, 200bおよび20b upper basin のDNA fragment をルシフェラーゼ伝子の上流にINSERT した.また、ルシフェラーゼActivityの値をstandardized するため、メダカ・βアクチンのプロモーターを组み込んだプラスミドも CONSTRUCTION した. Now, each レポータープラスミドを10℃および30℃ domesticated メダカのbone gridにNote After entering し, その, 5, 10 および15 days, the activity of のルシフェラーゼ was measured in である.