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合成DNAマイクロアレイによる病態関連遺伝子解析法の開発

利用合成DNA微阵列开发疾病相关基因分析方法

基本信息

批准号：
00J60202
负责人：
今井順一
金额：
$ 1.54万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-00J60202/
关键词：
DNAマイクロアレイ薬剤耐性遺伝子発現 Doxorubicin 乳癌

项目摘要

前年度までに、ある程度、DNAマイクロアレイ技術の確立とそのプロトコルの確定を行ってきたが、本年度はさらに確実なものとするために、プローブ作製に関しての条件検討を進めてきた。すなわち、プローブ作製の際に、Cy5あるいはCy3という蛍光で標識するが、その反応条件(各種試薬、例えばプライマー、dNTP、酵素等)、プローブの精製方法、ハイブリダイゼーションの条件、洗浄の条件等を検討し、現段階での最適条件を確定した。確立したプロトコルにしたがって、本年度は、癌の薬剤耐性に関して発現の変化する遺伝子の探索をDNAマイクロアレイを用いて研究した。まず、最初に薬剤耐性株の作成を試みた。培養液中に抗がん剤の一種であるDoxorubicinを加え、低濃度から濃度を増加して培養を続けると、薬剤に対して耐性を獲得した細胞は増殖を続けることが知られている。そこで、本研究では乳癌の細胞であるMCF-7およびT-47Dに対して、Doxorubicinを25ng/mlの濃度で投与した後、そのまま1週間培養した。1週間培養後の細胞を一部TRIzol溶液で溶解し、totalRNAを抽出した。また、残りの細胞をDoxorubicinを除いた培地で1週間培養して回復させた後、さらに、Doxorubicinを100ng/mlの濃度で投与し、そのまま1週間培養を続けた。1週間培養後の細胞を同様にして、各細胞からtotalRNAを抽出した。これらの各細胞から抽出したtotalRNAからpoly(A)+RNAを精製した後、プロトコルにしたがってサンプルに対して蛍光標識を行い、DNAマイクロアレイを行った。その結果、薬剤を投与した各細胞において薬剤耐性の指標であるP-糖蛋白(MDR : Multidrug resistance)遺伝子の上昇が確認された。しかし、MDR遺伝子にはいくつかのサブタイプが存在していることが知られているが、MCF-7及びT-47D細胞の間では、その発現上昇するMDR遺伝子のタイプが異なることがわかった。また、発現変化のあった遺伝子群が多数検出されたが、現在それらの遺伝子群について解析しているとともに、細胞をMDA-MB-453、A2058の2種類について新たに同様の実験を行い、DNAマイクロアレイで解析をする予定である。

Previous year's までに、あるdegree、DNAマイクロアレイTechnology Establishmentとそのプロトコルのdeterminationを行ってきたが, this year's はさらに真実なものとするために, プローブ产に关してのconditions検検を进めてきた.すなわち, プローブ产の记に, Cy5あるいはCy3という蛍Light mark するが, そのreaction conditions (various test cases, examples えばプライマー, d NTP, enzymes, etc.), purification method of プローブの, ハイブリイゼーションの conditions, washing conditions, etc. are not discussed, and the optimal conditions are currently determined. Establishment of the current year's cancer tolerance and cancer tolerance Now we can explore the DNA changes and use them to research the DNA. This is the first test of the resistant strains of fenugreek. In the culture medium, there is a kind of anti-doxorubicin and a low concentration of doxorubicin.てCultivate を続けると, 薬剤に対してresistant をobtain したcells はproliferation を続けることが知られている. Dox After administration of orubicin at a concentration of 25ng/ml, it was cultured for 1 week. After culturing for 1 week, part of the cells were dissolved in the TRIzol solution and total RNA was extracted.また, residual cells をDoxorubicin を except いた cultivating ground で 1 week culture して recovery させたさらDoxorubicin was administered at a concentration of 100ng/ml and cultured for 1 week. After culturing for 1 week, the cells were extracted together and the total RNA of each cell was extracted. After extracting total RNA from each cell and purifying poly(A)+RNA,プロトコルにしたがってサンプルに対して荍光码を行い,DNAマイクロアレイを行った. The result of the drug administration was to confirm the increase in P-glycoprotein (MDR: Multidrug resistance) of each cell and the index of drug resistance.しかし, MDR 缝子にはいくつかのサブタイプがexistent していることが知られているが, MCF- 7 and びT-47D cells, の间では, その発 Now increased, するMDR 伝子のタイプがISO なることがわかった. Now, nowそれらの缝子群についてanalyticsしているとともに、cellをMD A-MB-453, A2058の2 kinds of new ones are the same as the original ones, and DNAマイクロアレイでanalytics are predetermined.