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枯草菌と大腸菌におけるトランス・トランスレーションの標的タンパク質の網羅的解析

枯草芽孢杆菌和大肠杆菌中反式翻译靶蛋白的综合分析

基本信息

批准号：
12206011
负责人：
武藤あきら
金额：
--
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

tmRNA(10Sa RNA)は真正細菌に存在する安定なRNAで、tRNAとmRNAの両機能を合わせ持ち、trans-translationという特殊な翻訳機構を通して翻訳が中断したペプチドにタグを付加して特殊なタンパク質分解酵素(Fts,Clpなど)で分解する。最近我々はtrans-translation機構は一般的な不完全ペプチドの分解だけではなく、特定の標的タンパク質を標的として分解するというデータを得ている。本研究ではtmRNA変異株を用いて各種生理的条件下でのこの分解系の標的タンパク質を網羅的に解析することにより、その生理的意義ならびに分子機構を解明し、さらにtrans-translationの新しい遺伝子発現制御機構としての位置を確立すること目的とする。今回我々は、大腸菌と枯草菌でin vivoにおけるトランス翻訳反応産物を検出する系を確立した。タグペプチド(大腸菌で11アミノ酸、枯草菌で15アミノ酸)のC-端の疎水性アミノ酸が特異的proteaseに認識されペプチドは分解されるので、その配列を親水性のアミノ酸に変えることによりタグが付加したペプチドは分解から免れる。さらにタグの内部配列をヒスチジン6個を並べた配列にすることによりHis-tagを持たせる。そのように配列を変えた変異体tmRNA遺伝子を導入した菌ではHis-tagをもつトランス翻訳産物が分解されず細胞内に蓄積される。その全タンパク質からニッケルカラムを用いてHis-tagをもつペプチドを分画し、それを1次元または2次元ゲル電気泳動で分画後、His-tag抗体を用いたWestern-blottingによりHis-tagラベルされたタンパク質を検出・単離する。そのN-端のアミノ酸配列を決定しデータベースで検索することにより同定する。我々はすでにこの方法で大腸菌のいくつかの標的タンパク質を検出することに成功した。また枯草菌の検出系も確立し、種々の生理的条件下での標的タンパク質の単離を行っている。

tmRNA(10Sa RNA) is a stable RNA, tRNA and mRNA that function in real bacteria. It is a function of trans-translation and special translation mechanisms. It is a function of special translation enzymes (Fts,Clp). Recently, I have been trying to find out more about trans-translation agencies than about general incomplete translation. In this study, we analyzed the molecular mechanism of the target gene of the tmRNA translation system under various physiological conditions, and established the position of the new gene expression control mechanism. Now we have established a system for detecting Escherichia coli and Bacillus subtilis in vivo. The C-terminal amino acid of the C-terminal amino acid (Escherichia coli, Bacillus subtilis, 11-amino acid) is recognized as a specific protease, and the sequence of the amino acid is hydrophilic. The internal arrangement of the two groups is as follows: In addition, the gene expression of tmRNA is transformed into His-tag, and the product is accumulated in the cell. All His-tag antibodies are used in Western-blotting, and His-tag antibodies are used in Western blotting. The N-terminal acid sequence is determined by the same parameter. The method was successful in producing E. coli. Under physiological conditions, the growth of Bacillus subtilis was established and the quality of its production was improved.