概日リズムのPDHペースメーカーホルモン受容体の発現クローニング

甲殻類の色素拡散ホルモンとして当初発見された神経ペプチドPigment-Dispersing Hormone(PDH-)が一連の節足動物、昆虫で相次いで単離・同定され、近年、概日リズムのペースメーカーペプチドであることが強く示唆されている。PDHの受容体を同定し、概日リズム発現の分子機構を明らかにするために、特有の内在性PDHペプチドを持ち、概日リズムの発現が明らかなショウジョウバエについて、下記の実験を遂行し、成果を得た。(1)PDHペプチドの化学合成および放射ラベル誘導体の調製ショウジョウバエのPDH(18-ペプチド)およびトリチウムによる放射標識が可能な前駆体として、デヒドロロイシン(ΔLeu)を4位に含むPDHアナログを化学合成した。この前駆体ペプチドについて、3H2ガスによるトリチウム標識を実施(アマシャム社に依頼)して[3H]PDHを合成した。測定の結果、ロイシン残基にトリチウム原子7個が導入された放射標識ペプチドがHPLCで単一画分として得られた。(2)[3H]PDHを用いた脳ホモジネートに対する結合試験得られた[3H]PDHをトレーサーとして、ショウジョウバエ脳ホモジネートに対して結合試験を実施し、特異的結合の測定を試みた。その結果、結合タンパクの存在を示唆する結果が得られた。しかしながら、試料によって十分な再現性を得ことができていないため、現在詳しい条件検討を行なっている。(3)PDHペプチドに対する脳内結合タンパク質(受容体)の発現クローニングショウジョウバエ頭部のcDNAライブラリーを、国際研究機関であるBerkeley-Drosophila Genome-Projectより入手した。現在、これを培養真核細胞に形質導入するため、条件等を検討している。今後、機能発現クローニングにより、PDHペプチド受容体のクローニングを試みる予定である。また、他の時計タンパク質のクローニングも併せて行ない、それらとPDHとの相互作用についても検討してゆく。

甲殻類の色素拡散ホルモンとして当初発見された神経ペプチドPigment-Dispersing Hormone(PDH-)が一連の節足動物、昆虫で相次いで単離・同定され、近年、概日リズムのペースメーカーペプチドであることが強く示唆されている。PDHの受容体を同定し、概日リズム発現の分子機構を明らかにするために、特有の内在性PDHペプチドを持ち、概日リズムの発現が明らかなショウジョウバエについて、下記の実験を遂行し、成果を得た。(1)PDHペプチドの化学合成および放射ラベル誘導体の調製ショウジョウバエのPDH(18-ペプチド)およびトリチウムによる放射標識が可能な前駆体として、デヒドロロイシン(ΔLeu)を4位に含むPDHアナログを化学合成した。この前駆体ペプチドについて、3H2ガスによるトリチウム標識を実施(アマシャム社に依頼)して[3H]PDHを合成した。測定の結果、ロイシン残基にトリチウム原子7個が導入された放射標識ペプチドがHPLCで単一画分として得られた。(2)[3H]PDHを用いた脳ホモジネートに対する結合試験得られた[3H]PDHをトレーサーとして、ショウジョウバエ脳ホモジネートに対して結合試験を実施し、特異的結合の測定を試みた。その結果、結合タンパクの存在を示唆する結果が得られた。しかしながら、試料によって十分な再現性を得ことができていないため、現在詳しい条件検討を行なっている。(3)PDHペプチドに対する脳内結合タンパク質(受容体)の発現クローニングショウジョウバエ頭部のcDNAライブラリーを、国際研究機関であるBerkeley-Drosophila Genome-Projectより入手した。現在、これを培養真核細胞に形質導入するため、条件等を検討している。今後、機能発現クローニングにより、PDHペプチド受容体のクローニングを試みる予定である。また、他の時計タンパク質のクローニングも併せて行ない、それらとPDHとの相互作用についても検討してゆく。