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草原性植物根に共生するVA菌根菌のDNAマーカーによる直接同定法の確立

草原植物根部共存VA菌根真菌DNA标记直接鉴定方法的建立

基本信息

批准号：
12876057
负责人：
菅原和夫
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12876057/
关键词：
VA菌根 PCR 18SrDNA 種同定 PCRプライマー系統解析 DNAマー Glomales目 18S rDNA DNAマーカー DNA抽出

项目摘要

昨年までの研究によりVA菌根菌からのDNA抽出法としてはボイル法が有効であること、またPCR増幅法としてnested PCRが有効であることを明らかとした。しかし、野外植物に感染するVA菌根菌をPCRで検出・同定するには、既存のVA菌根菌特異的プライマーでは限界があることが確認された。そこで本年度はDNAデータベース検索により、新たなVA菌根菌特異的プライマーの作出を試みた。また同時に、増幅したDNA断片の塩基配列をもとに系統解析を行い感染菌の同定を試みた。材料として野草地から採取したススキ菌根およびシバ菌根を用いた。Nested PCRに適したVA菌根菌特異的プライマーとしてMycF-MycRおよびAMF・AMRプライマーを設計した。Nested PCR後、増幅産物をサブクローニングし、タイプ分けのため6種の制限酵素にてPCR-RFLP解析を行った。247クローンについて解析した結果、57種類のRFLPパターンを得た。各RFLPパターンごとに塩基配列を決定し系統解析したところ、67クローン中64クローンがアーバスキュラー菌根菌の系統に属していることが確認され、プライマーの特異性の高さが示された。また、VA菌根菌系統はいくつかのグループから成ることが確認され、これら一連の方法により感染菌の詳細な分類群レベルの検出が可能となった。さらに、これらのグループを識別する制限酵素の組み合わせとしてMboI, Hsp92II, HpyCH4IVが有効であることが示され、感染菌構成の迅速な定量化が可能となった。以上、一連の研究により根中のVA菌根菌構成を詳細な分類群レベルでかつ定量的に解析することが可能となった。今後、野外のVA菌根菌研究への応用が期待される。

Last year, we researched the DNA extraction method of VA mycorrhizal bacteria, the effective method, and the PCR amplification method, nested PCR is effective and effective.しかし, wild plant infection するVA mycorrhizal bacteria をPCR で検・同定するには, existing のVA mycorrhizal bacteria specific プライマーでは limit があることがconfirmation された. This year's はDNA データベース検SO により, new たなVA mycorrhizal bacteria-specific プライマーのをtest みた. At the same time, the system analysis of the DNA fragments and the amplification of the DNA fragments was carried out, and the same determination of the infectious bacteria was carried out. Materials: として野草から Take したススキMycorrhizal およびシバMycorrhizal を Use いた. Nested PCR is suitable for VA mycorrhizal fungi-specific プライマーとしてMycF-MycR およびAMF・AMR プライマーを design. After Nested PCR, the amplified products were analyzed by PCR-RFLP using 6 kinds of restriction enzymes, including 6 kinds of restriction enzymes, including をサブクローニングし and タイプ分けのため. 247クローンについて analysis results, 57 types of RFLPパパーンをgets. Each RFLP base arrangement is determined by system analysis, 67 クローン中64クローンがアーバスキュラーMycorrhizal fungus systemのgenusしていることがconfirmationされ,プライマーのspecificityの高さがshowされた.また、VA mycorrhizal fungus systemはいくつかのグループから成ることがconfirmされ、これら一连のmethodによりInfectious bacteriaのDetailsなtaxonomic groupレベルの検出がpossibleとなった. MboI, Hsp92II, HpyCH4IV is effective and can be shown to be effective, and the composition of infectious bacteria can be quantified quickly and easily. The above is a series of studies on the composition of VA mycorrhizal fungi in the roots, a detailed analysis of the taxonomic groups, and a quantitative analysis of the VA mycorrhizal fungi. In the future, we look forward to further research on VA mycorrhizal fungi in the field.