权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

有機合成化学を基盤とする非天然型有用生体機能物質の創製

基于有机合成化学创造非天然有用的生物功能物质

基本信息

批准号：
01J01419
负责人：
早川裕之
金额：
$ 2.5万
依托单位：
The University of Tokyo (2003)Nagoya University (2001-2002)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

siRNAを用いるRNAi研究を行った。現在非常に注目を集めている哺乳動物の細胞内でsiRNAを発現させる場合、それらを発現する長い遺伝子を羅患部位に直接接種あるいは点滴等を用いて静注することが必須となる。ここで大きな問題となるのが導入する遺伝子(DNA)の生体内での安定性である。生体外部から導入された遺伝子の生体内での寿命は一般的に極めて短く、それらは導入後まもなく何の機能をも果たさなくなるほどの長さに細かく切断される。それは生体自身が持つ生体外物質に対する基本的防御機構によるものであり、その役割を直接的に果たすのがexo-およびendo-nucleaseである。そこで各種nucleaseに抵抗しうる鋳型DNAの調整法を確立した。まず天然型dATP、dCTP、dGTPおよびα-ボラノチミジン三リン酸存在下、PCR法を用いて任意のdsDNAを複製した。このdsDNA中に存在するすべてのチミジンの5'-側リン酸部位では、リン酸部位の水酸基が完全にホウ素に置換されている。また複製されたdsDNAの塩基配列はシーケンス解析によって確認した。得られたdsDNAにはT7RNAポリメラーゼプロモーターが存在するためT7RNAポリメラーゼを用いて転写試験を行ったところ、ボラノホスフェートDNAから初めてRNAが転写されたことが確認された。さらにプロモータ部位に存在するチミジンの5'-側リン酸部位は天然型リン酸型でもボラノホスフェート型でもいずれの場合でも問題なく転写は進行した。同様にすべてのヌクレオシド三リン酸をα-ボラノホスフェート三リン酸に置き換えてPCR法を用いてcircular DNAから任意の部位をdsDNAとして複製したところ、問題なくすべてのリン酸部位がホウ素化されたボラノホスフェートDNAを得ることができた。このようにして調整されたボラノホスフェートDNAを用いてRNAi実験を行ったところ、天然型DNAと同じようにRNAi活性を示すことが確認された。続いてボラノホスフェートDNAのexo-およびendo-nucleaseに対する耐性を検証したところ、exo-nucleaseに対して完全な耐性を示したもののendo-nucleaseに対しては天然型DNAのそれと同程度あるいはendo-nucleaseによっては天然型DNAよりも耐性がないことが確認された。この特異な性質は、DNA骨格にBH3が存在することによって生じたDNAの全体構造のひずみや、二本鎖DNA構造の不安定化が引き起こす部分的一本鎖構造の存在確率の上昇がendo-nuclease耐性を著しく下げているためだと考えられる。さらに研究を進めていった結果、同様の理由からヒト血清に対する耐性も著しく低いことが確認された。

RNAi research is underway. It is very important to focus on the development of siRNA in mammalian cells, such as direct inoculation, intravenous injection, etc. The stability of DNA in vivo is a major problem. The life span of the introduced gene in the organism is very short, and the function of the introduced gene is very short. The organism itself maintains the basic defense mechanism against the extracellular substances, and the direct effect of the enzyme is exo-and endo-nucleotide. A method for regulating DNA resistance to various nucleases has been established. In the presence of natural forms of dATP, dCTP, dGTP and α-amino acids, arbitrary dsDNA can be replicated by PCR. This dsDNA contains a complete substitution of the amino acid group at the 5'-flanking acid site of the protein. The sequence of dsDNA was analyzed and confirmed. T7RNA is the first to be identified by DNA. In the case where the 5'-side acid site of the natural type exists, the problem is solved. In the same way, the circular DNA was used to replicate any part of the DNA. This is the first time that we've seen this. To the same extent as the native DNA, the exo-nucleotide and endo-nucleotide resistance of the native DNA were verified. The presence of BH3 in the endo-nucleases of DNA and its specific properties increased the stability of DNA and its endo-nucleases in the whole DNA structure. The results of the study were similar to those of the previous study.