血小板活性化因子生合成酵素の単離とcDNAクローニング

点击翻译按钮获取中文摘要

血小板活性化因子生合成酵素の活性調節機構を調べるため、WT、LPS受容体(TLR4)ノックアウトマウス、及びTLR4の下流分子であるMyD88のノックアウトマウス腹腔マクロファージをLPS又は、PAFアナログであるmc-PAFで刺激した。また、マクロファージをLPSで前処理し、続いてmc-PAFで刺激するLPSプライミング効果についても調べた。マウスマクロファージの本酵素活性は、(1)PAF受容体刺激による"秒"単位の活性化、(2)LPS刺激によるMyD88、p38 MAPK依存的な"分"単位の活性化、(3)LPS刺激によるMyD88非依存的な"時間"単位の活性化の少なくとも3種類の経路で調節されていることがわかった。また、LPS刺激による本酵素の活性化は2層性であることもわかった。このうち、後半の活性化(3)でのみLPSプライミング効果が観察され、それはMyD88非依存経路で調節されていることが明らかとなった。また、この活性化はタンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドで抑制された。以上のことから、血小板活性化因子生合成酵素のクローニングを目的として、MyD88ノックアウトマウスの細胞をLPSで刺激し、GeneChip解析を行っている。別のアプローチとしてゲノムデータベースの利用も行っており、基質、機能が不明のo-アセチル転移酵素をクローニングしたが、PAF合成酵素活性は持たなかった。タンパク質精製からのアプローチでは、カラムクロマトグラフィーにより部分精製した試料をSDS-PAGEし、タンパク質のバンドを切り出し、同定することを試みている。