Arthromces ramosus peroxidaseの酸化反応機構の解明

枝节节过氧化物酶氧化反应机制的阐明

• 批准号: 01J10374
• 负责人: 野中 大輔
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J10374/
• 关键词: ペルオキシダーゼ; ヘム; 過酸化水素; 酸化反応中間体; 過酸化水素の活性化; アルギニン残基; ヘムタンパク質; 大腸菌発現系; 巻き戻し; 担子菌; ヒトヨタケ

前年度までにArthromces ramosus peroxidase(ARP)の大腸菌による発現系を構築し、大腸菌によりARPのポリペプチドは封入体として生成されること、さらにin vitroでの巻き戻しについて検討を行った。しかしながら、ARPはその構造中に4つのジスルフィド結合を有することからグルタチオンを用いた巻き戻しを検討したところ、高pH側で巻き戻しの効率が上昇することが明らかとなったものの、同時に高pH条件ではARPそのものが不安定であるため、全体では1%程度の巻き戻し効率しか得られなかった。このため、今年度はメタノール資化性酵母pichia pastorisでの発現系の構築を試みた。ARP cDNAを導入した菌体外への発現シグナルを有するベクターを構築し、pichia pastorisへと導入した。培養24時間後にメタノールにて発現を誘導したところARP群が確認された。さらに、ARPの活性発現に必須であるヘムの前駆体であるアミノレブリン酸およびFe^<2+>の添加により、活性型タンパク質の発現が促進されることが明らかとなった。現在、過酸化水素との反応に重要であるとされているアルギニン残基変異体の解析を行うべく変異体の発現・解析を行っている。

In the past year, the development system of Arthromces ramosus peroxidase(ARP) in Escherichia coli was constructed, and ARP was isolated from Escherichia coli. In the structure of ARP, the efficiency of ARP on the high pH side increased to 1% under the condition of high pH, and the stability of ARP increased to 1% under the condition of high pH. This year, the development system of yeast pichia pastoris was constructed. ARP cDNA is introduced into the genome of a bacterium. After 24 hours of incubation, the ARP was identified. In addition, the addition of Fe^<2+> to the precursor of ARP is necessary for the activation of ARP, and the activation of ARP is promoted. Now, it's important to analyze the amino acid residues in order to find out how they occur.