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ドミナントネガティブ体を用いた膜型1マトリックスメタロプロテアーゼの機能解析

使用显性失活细胞进行膜 1 型基质金属蛋白酶的功能分析

基本信息

批准号：
12680626
负责人：
伊藤義文
金额：
$ 2.37万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

可溶型のMMP2は潜在型として組織中に存在するが、活性化に際しては細胞の表面に濃縮される。この際にTIMP-2が、N末のインヒビタードメインにてMT1-MMPと結合し、C末のドメインにて潜在型MMP-2の結合することによって、MT1-MMP発現細胞に潜在型MMP2が結合する為のアダプターの役割を果たす。複合体中のMT1-MMPは抑制状態にあるためにMMP2の活性化はできない。そこで近接した位置にありアクチベーター役として働くもう1分子のMT1-MMPが必要である。このような2分子のMT1-MMPが近接する仕組みを検証した。リコンビナント酵素のゲルろ過による精製過程で、MT1-MMPが見かけの分子量の整数倍の位置に溶出することを見出した。このような複合体形成はPEXドメインに依存した。実際の細胞上でもこのような複合体が形成されていことは、FLAGおよびMyc-tagで標識した分子を同時に発現して、抗FLAG抗体によってMyc-tag標識した分子が共沈すること、また、逆の実験が成立することで示された。PEXドメインを欠いた変異体MT1-MMPには複合体系性能はなく、同時にMMP-2の活性化能も失っていた。次に、細胞外領域はMT1-MMPに由来し、細胞膜貫通および細胞内ドメインは神経成長因子受容体(NGF-R)に由来するキメラ蛋白質を細胞に発現させて、MT1-MMPのホモ複合体形成を可視化することを試みた。MT1-MMPは細胞運動に際して運動の先進部に局在することが知られている。細胞に活性型Racを発現させて、MT1-MMPがラメリポデイアに局在するような状況を作ってやると、NGF-Rのリン酸化が細胞外のPEXドメインに依存して同様の場所で引き起こされることを確認した。同時にMMP-2の活性化も誘導されることが確認された。

Soluble MMP-2 is present in latent form and concentrated on the surface of cells when activated. At this time, TIMP-2 binding, N-terminal protein binding, C-terminal protein binding, latent MMP-2 binding, MT1-MMP producing cells binding, latent MMP-2 binding, and N-terminal protein binding were detected. MT1-MMP in the complex is inhibited and MMP2 is activated. MT1-MMP is necessary for the next position. The MT1-MMP of the two molecules are closely related to each other. During the purification process of MT1-MMP, the position of MT1-MMP in integral multiple of molecular weight was found The complex formation depends on PEX. In fact, the formation of a complex on the cell is shown by the simultaneous expression of FLAG and Myc-tag molecules, and the co-expression of anti-FLAG antibodies and Myc-tag molecules. PEX-1-MMP complex system performance and MMP-2 activation Second, the extracellular domain MT1-MMP origin, cell membrane penetration and intracellular growth factor receptor (NGF-R) origin, protein production in the cell, MT1-MMP complex formation visualization. MT1-MMP is the most advanced part of cell movement. The expression of cellular active Rac, MT1-MMP, and the expression of NGF-R are dependent on the extracellular PEX system. At the same time, MMP-2 activation was induced and confirmed.