ヒト角膜内皮細胞のcDNA作成および角膜内皮に異常をきたす原因遺伝子の解明

昨年度、ヒト正常角膜内皮細胞のcDNAプロファイルを作成した。この中で、角膜内皮細胞への発現数が多く特異性が高い未知遺伝子のクローニングを行い、Homo sapiens corneal endothelium specific protein 1(以下CESP-1)としてGenBankに登録した。今年度は、CESP-1の角膜内皮細胞における役割を追求するために、機能解析を行っている。CESP-1は、一次構造から予想される特徴的なモチーフが存在しないため、以下の2つの方法で機能解析を進めている。(1)立体構造の解析CESP-1を大腸菌で大量発現させ、精製したものを結晶化することにより、その構造解析を行う。・大腸菌によるCESP-1の発現系の構築CESP-1をヒスチジンタグがN末端に付加されたpET-16bベクターに挿入した後、BL21(DE3)pLysS株に導入した。Isopropylthio-β-D-galactosideによる発現誘導を行い、大量培養を行った。ソニケーションによりタンパク質を抽出し、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法でCESP1の発現を確認した。・CESP-1の精製イオン交換クロマトグラフィーとヒスチジン吸着クロマトグラフィーを用いてCESP-1の精製を行った。さらにCESP-1を大量に精製し、そのサンプルをもとに結晶化による構造解析を行う。(2)相互作用タンパク質の探索ヒト角膜内皮細胞は入手が困難なため、ウサギを代用した。ウサギの角膜内皮細胞からtotal RNAを抽出し、既知の配列をもとに5'RACE法を行い、CESP-1に相当するウサギの遺伝子の全長をクローニングした。今後BacterioMatch^<TM>Two-Hybrid System XR cDNA Library Construction Kitを用いて、two-hybrid system法を行う予定である。

昨年度、ヒト正常角膜内皮細胞のcDNAプロファイルを作成した。この中で、角膜内皮細胞への発現数が多く特異性が高い未知遺伝子のクローニングを行い、Homo sapiens corneal endothelium specific protein 1(以下CESP-1)としてGenBankに登録した。今年度は、CESP-1の角膜内皮細胞における役割を追求するために、機能解析を行っている。CESP-1は、一次構造から予想される特徴的なモチーフが存在しないため、以下の2つの方法で機能解析を進めている。(1)立体構造の解析CESP-1を大腸菌で大量発現させ、精製したものを結晶化することにより、その構造解析を行う。・大腸菌によるCESP-1の発現系の構築CESP-1をヒスチジンタグがN末端に付加されたpET-16bベクターに挿入した後、BL21(DE3)pLysS株に導入した。Isopropylthio-β-D-galactosideによる発現誘導を行い、大量培養を行った。ソニケーションによりタンパク質を抽出し、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法でCESP1の発現を確認した。・CESP-1の精製イオン交換クロマトグラフィーとヒスチジン吸着クロマトグラフィーを用いてCESP-1の精製を行った。さらにCESP-1を大量に精製し、そのサンプルをもとに結晶化による構造解析を行う。(2)相互作用タンパク質の探索ヒト角膜内皮細胞は入手が困難なため、ウサギを代用した。ウサギの角膜内皮細胞からtotal RNAを抽出し、既知の配列をもとに5'RACE法を行い、CESP-1に相当するウサギの遺伝子の全長をクローニングした。今後BacterioMatch^<TM>Two-Hybrid System XR cDNA Library Construction Kitを用いて、two-hybrid system法を行う予定である。