ヒト角膜内皮細胞のcDNA作成および角膜内皮に異常をきたす原因遺伝子の解明

建立人角膜内皮细胞的 cDNA 并阐明导致角膜内皮异常的基因

• 批准号: 13771039
• 负责人: 酒井 理恵子
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Jichi Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13771039/
• 关键词: ヒト角膜内皮細胞; CESP-1; ヒスチジンタグ; cDNAライブラリー; GS3582

昨年度、ヒト正常角膜内皮細胞のcDNAプロファイルを作成した。この中で、角膜内皮細胞への発現数が多く特異性が高い未知遺伝子のクローニングを行い、Homo sapiens corneal endothelium specific protein 1(以下CESP-1)としてGenBankに登録した。今年度は、CESP-1の角膜内皮細胞における役割を追求するために、機能解析を行っている。CESP-1は、一次構造から予想される特徴的なモチーフが存在しないため、以下の2つの方法で機能解析を進めている。(1)立体構造の解析CESP-1を大腸菌で大量発現させ、精製したものを結晶化することにより、その構造解析を行う。・大腸菌によるCESP-1の発現系の構築CESP-1をヒスチジンタグがN末端に付加されたpET-16bベクターに挿入した後、BL21(DE3)pLysS株に導入した。Isopropylthio-β-D-galactosideによる発現誘導を行い、大量培養を行った。ソニケーションによりタンパク質を抽出し、抗ヒスチジンタグ抗体を用いたウエスタンブロット法でCESP1の発現を確認した。・CESP-1の精製イオン交換クロマトグラフィーとヒスチジン吸着クロマトグラフィーを用いてCESP-1の精製を行った。さらにCESP-1を大量に精製し、そのサンプルをもとに結晶化による構造解析を行う。(2)相互作用タンパク質の探索ヒト角膜内皮細胞は入手が困難なため、ウサギを代用した。ウサギの角膜内皮細胞からtotal RNAを抽出し、既知の配列をもとに5'RACE法を行い、CESP-1に相当するウサギの遺伝子の全長をクローニングした。今後BacterioMatch^<TM>Two-Hybrid System XR cDNA Library Construction Kitを用いて、two-hybrid system法を行う予定である。

The cDNA of normal corneal endothelial cells was prepared in the same year. Homo sapiens corneal endothelial specific protein 1(hereinafter CESP-1) is registered in GenBank. This year, CESP-1 corneal endothelial cells in the pursuit of functional analysis. CESP-1 is a structure that is designed to be characterized by the existence of the following 2 methods for functional analysis. (1)Analysis of three-dimensional structure CESP-1 Escherichia coli is produced in large quantities, refined and crystallized, and structural analysis is performed. The expression of CESP-1 in E. coli was constructed by introducing the BL21 (DE3)pLysS strain into the N-terminal region of CESP-1. Isopropylthio-β-D-galactoside was induced and cultured in large quantities. The detection of CESP1 was confirmed by the detection of CESP1 by anti-CESP1 antibody. CESP-1 purification process is carried out in the presence of CESP-1 CESP-1 was refined in large quantities and crystallized. (2)Corneal endothelial cells are difficult to access and replace. Total RNA was extracted from the corneal endothelial cells, and the 5'RACE method was used to detect the total RNA of the corneal endothelial cells. BacterioMatch^<TM>Two-Hybrid System XR cDNA Library Construction Kit for future use, two-hybrid system method for future use

项目成果

Sakai R: "Construction of Human Corneal Endothelial cDNA Library and Identification of Novel Active Genes"Invest Ophthalmol Vis Sci. 43. 1749-1756 (2002)

Sakai R：“人角膜内皮 cDNA 文库的构建和新型活性基因的鉴定”Invest Ophasemol Vis Sci。

Rieko Sakai: "Construction of Human Corneal Endothelial cDNA library and Identification of Novel Active Genes"Investigative ophthalmology & visual science. (発表予定).

Rieko Sakai：“人类角膜内皮 cDNA 文库的构建和新型活性基因的鉴定”研究眼科学和视觉科学（待提交）。