歯周病原性細菌の産生するプロテアーゼの高次構造形成と輸送機構に関する研究

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Arg-gingipain (Rgp)とLys-gingipain (Kgp)は歯周病原性細菌Porphyromonas gingivalis (P.g.)が産生する主要なシステインプロテアーゼである。精製酵素によるin vitroの実験から、両酵素は個別に、あるいは相互に協力しながら、宿主蛋白質の分解や宿主細胞の傷害を引き起こし、歯周病に関連するさまざまな病態を生み出すと考えられている。しかし、それらの酵素の輸送機構あるいは局在部位に関する情報は非常に少ない。大腸菌での発現においては活性型酵素が得られなかったため、本研究期間ではP.g.菌体内で安定に維持できるプラスミドpYKP028を用い、Kgpの発現を試みた。昨年度構築した2種類のうちカルボキシ末端側の血球凝集素ドメインをほとんど欠いた遺伝子を発現ベクターに挿入し、大腸菌との接合伝達によりP.g.に導入した。テトラサイクリンにより菌株を選別したところ、いくつかのクローンが得られた。培養上清、菌体内の両方にKgp活性が存在し、ウエスタンプロット解析にても確認された。すなわち、リコンビナントKgpは野生型におけるKgpと同じように分泌型と膜結合型が存在することが明らかとされた。また、Kgpはヘムの取り込みに関与しており、その欠損変異株ではP.gの特徴の一つである黒色色素産生能を失うことが知られている。そこで、血液寒天培地にて培養したところ、黒色色素産生能が回復していることが示された。同時に、Kgpと血球凝集素ドメインを全て含んだkgpの全遺伝子を含んだ領域もpYKP028に挿入し、同じようにP.g.に導入した。ところが、こちらはKgpの発現が認められなかった。現在この理由は解明されていないが、今後メッセンジャーレベルでの解析を試みる予定である。