歯科領域における遺伝子治療の基礎実験について

牙科领域基因治疗基础实验

基本信息

  • 批准号:
    13771153
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 1.28万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2001
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2001 至 2002
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

歯科領域において、歯牙が欠損した後の顎骨の保全は重要な課題であり、顎骨量は補綴処置等の難易・のちのQOLを左右する因子と考えられる。そこで骨吸収を抑制することで、骨量維持・骨形成促進させることを目標に、骨代謝調節に重要であるといわれているOsteoprotegerin(OPG)に着目し、遺伝子治療を見据えたOPG発現ベクターの開発を試みた。平成13年度にはmouse OPG(mOPG)部分断片cDNAをクローニングし、in vitro蛋白質発現系の構築を行なっていた。平成14年度に新たにmOPGの全長cDNAを松本歯科大・宇田川教授より供与を受け、プライマーの設計を再び行なう。テンプレートはpT7Blue-mOPGとし、pyrobestを用いPCRを行いPCR産物を得た。その後PCR産物をフェノール・クロロフォルム処理を行なうことにより精製した。この精製したOPGcDNAと動物細胞発現用ベクターを酵素であるBamH1にて処理をし,その後QIAEXIIによるビーズ処理をし、電気泳動で確認。そしてここでligationを行い大腸菌(DH5α)にDNAを導入した。DNA導入された大腸菌をLA plateに播種し、colonyの出現を確認。そのおのおののcolonyをmini prepにてDNA導入の成否を確認。導入されていた大腸菌のみを再度LA plateに播き出現したcolonyをLA-broth 100ml入ったフラスコで大量培養を行なう。オーバーナイトで培養後、MARUGEN社のHIGH PURITY MAXIPREPにて精製を行い、OPG plasmid DNAを大量に回収。電気泳動にてプラスミドDNAの確認を行なう。まず株化osteosarcoma(MG63)を導入対象細胞に選択し、蛍光プラスミドとしてGFPを用いBoehringer mannhem社FuGENE 6 Transfection reagentによりOPGを導入。24時間後、蛍光顕微鏡にて蛍光発色を起こしている細胞を確認した。結果導入効率は20%程であた。次に初代ヒト歯根膜線維芽細胞を用いたところ5%程の効率であった。このため導入効率、発現安定性を考慮しレトロウイルスベクターにより導入することが適切と考えmOPG発現レトロウイルスベクターの構築を行なった。現在細胞培養系・個体への導入を行なう段階である。
In the field of dentistry, the preservation of jaw bone after dental defects is an important issue, and the difficulty of jaw bone repair and treatment is related to the factors. Bone resorption inhibition, bone mass maintenance, bone formation promotion, bone metabolism regulation, Osteoprotegerin(OPG), gene therapy, and development of OPG. Construction of a mouse OPG(mOPG) partial fragment cDNA library and in vitro protein development system in Heisei 13 The full-length cDNA of mOPG was newly developed in Heisei 14 by Professor Udagawa of Matsumoto Dental University. pT7Blue-mOPG, pyrobest PCR products The PCR products were purified by PCR. The purification of OPG cDNA and the development of animal cells were confirmed by enzyme BamH1 treatment, post-QIAEX II treatment and electrophoresis. The introduction of Escherichia coli (DH5 α) DNA introduction into E. coli L. A plate was seeded and colony appearance confirmed. Confirm the success or failure of DNA introduction in colony mini prep The introduction of E. coli into the LA plate resulted in the emergence of a colony of LA-broth 100ml. High PURITY MAXIPREP of MARUGEN Corporation after culture, OPG plasmid DNA recovery in large quantities DNA identification by electrophoresis. The mutant osteosarcoma(MG63) was introduced into the target cells, and OPG was introduced into the target cells using Boehringer mannhem and FuGENE 6 Transfection reagent. After 24 hours, the light microscope was used to identify the cells. The result is that the import rate is 20%. The first generation of root membrane cells was used at a rate of 5% The introduction efficiency and development stability should be considered. The introduction of OPG should be considered appropriately. Now cell culture line·individual introduction stage

项目成果

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