Tissue Engineeringを応用した神経ペプチドの骨増成機転調節機構

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平成13年度までに、静水圧下での軟骨培養は大気圧のものと比べ、短期間にしかも大量培養できることが確認された.この手技を応用し、平成14年度では吸収性コラーゲンスポンジを足場とした軟骨細胞の三次元培養手技の確立と培養軟骨細胞ブロックが生体内でおよぼす影響について病理組織学的検討を行った。1)静水圧下での培養軟骨細胞ブロックの作製軟骨細胞はラット大腿骨から得られた軟骨細胞はpH7.4に調整した培地に10%胎仔ウシ血清を加え播種した。培地中にコラーゲンスポンジを積層したものを沈め、静水圧下(5MPa)での培養に供した。2)培養軟骨ブロックの移植13週齢のWistarラット(雄性)の大腿骨に骨欠損部を作製し、先に得られた培養軟骨細胞ブロックを移植し、移植後1〜5日、1、2、4週について観察を行った。対照群としては同様の操作を行い培養軟骨細胞を移植しないものを用いた。3)病理組織学的検討標本採取は動物を脱血後灌流固定し、大腿骨の全滴を行い病理組織学的な検討を行った。観察方法としては一般染色としてH・E染色、免疫組織化学的な神経繊維の索には微細な神経繊維の再現まで可能であるとされるProtein Gene Product 9.5(PGP 9.5)、また栄養神経的要素を持つとされているCalcitonin gene-related Peotide(CGRP)、Substance(SP)陽性線維について検討を行った。移植初期では対照群と比べ明らかな差は認められなかったが、対照群が4週で骨欠損部がほぼ新生骨に満たされているのに対し実験群では移植後2週から3週で骨欠損部はほぼ新生骨に満たされていた。また免疫組織化学染色では脱灰操作が加わるため染色性にバラツキがあった。今後さらなる検討を行い各抗体の詳細な経時的変化を検討する予定である。現在までに得られたデータをもとに培養軟骨ブロックが骨欠損部の修復過程におよぼす影響について血管網の3次元的観察、超微細構造について検討を行い、近い将来これらの技術が臨床応用されることを目指したいと考える。