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糖転移酵素GnT-IIIのアロステリック活性制御機構と糖鎖生合成における意義

糖基转移酶GnT-III变构活性控制机制及其在糖链生物合成中的意义

基本信息

批准号：
13780504
负责人：
鄭文玉
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Yamagata University (2002)Osaka University (2001)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

N-アセチルグルコサミン転移酵素III(GnT-III)はアスパラギン結合型糖鎖にbisecting GlcNAcを付加する反応を触媒し、高分岐型糖鎖の生合成を制御すると考えられている糖転移酵素である。本研究ではGnT-IIIのピロリン酸(PPi)による活性制御機構について検討した。精製リコンビナントGnT-IIIを用いたPA化2本鎖糖鎖およびUDP-GlcNAcを基質とする反応にピロリン酸を加えると濃度依存的に活性が阻害され、その阻害はKi=0.03mM、Hill定数=6〜10の非常に高い協同性をもつ2状態遷移によってよく説明できた。PPiはドナー、アクセプター、2価金属のいずれのリガンドとも競合しないことから、いわゆるアロステリックエフェクターとして作用すると考えられた。速度端的解析によって、PPiはドナーおよびアクセプターに対するKmをそれぞれ12倍、3.5倍に増加させる一方、Vmaxに大きな変化を起こさないことがわかった。さらに、様々なPPi濃度における内在性トリプトファン由来の蛍光の変化を調べてみると、0.03mM付近のPPi濃度で蛍光強度に変化が観察された。このような結果から、GnT-IIIはPPiをエフェクターとして協同的なコンフォメーション変化を起こし活性型(低Km型)から不活性型(高Km型)へと遷移することがわかったが、さらに、化学架橋実験により多量体構造をもつことも示唆されており、各サブユニット間の機能的な連絡によってこのような性質を発揮すると考えられた(投稿準備中)。さらに、触媒残基の置換による不活性変異体の発現が細胞の内在性GnT-IIIの機能を阻害するというdominant negative効果をもつことを見出しており、in vivoにおいてもhomophilic functional associationがある可能性を示唆することが出来た。

N-terminal glucose shift enzyme III(GnT-III) is an enzyme that catalyzes the synthesis of N-terminal glucose shift enzymes, which bind GlcNAc and control the synthesis of N-terminal glucose shift enzymes. In this study, we investigated the activity control mechanism of GnT-III and PPi. The purification of GNT-III is based on the addition of PA2 and UDP-GlcNAc to the substrate and concentration-dependent inhibition of GNT-III activity with Ki= 0.03 mM and Hill constant =6 ~ 10. Very high synergy between GNT-3 and UDP-GlcNAc is described. PPi is the most important part of the game, and the most important part of the game is the game. The analysis of the speed end, PPi, and Km are increased by 12 times, 3.5 times, and Vmax are increased by 2 times. The concentration of PPi in the sample was determined by the fluorescence intensity of PPi at 0.03mM. As a result, GnT-III PPi has evolved from an active type (low Km type) to an inactive type (high Km type) to a migration type (chemical bridging). The structure of the multi-volume structure is shown in the table, and the function of the connection between the components is examined (in preparation for submission). In vivo, the possibility of homophilic functional association is demonstrated by the discovery of inactive heterogeneic proteins that inhibit the intrinsic GnT-III function of the cell.