イオン輸送性膜蛋白質の細胞膜への局在化に関わるキネシンモーター分子の役割

驱动蛋白马达分子在将离子传输膜蛋白定位到细胞膜中的作用

• 批准号: 13780505
• 负责人: 中村 徳弘
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780505/
• 关键词: イオン輸送; 生体膜輸送; 生体膜タンパク質; モータータンパク質; キネシン; ナトリウムイオン

真核細胞には極めて複雑な膜系が存在し、その内部はそれぞれ固有のpHとイオン濃度に保たれている。イオン輸送性膜タンパク質は、脂質二重膜を介したイオンの輸送を行い、細胞質や細胞小器官内のpHやイオン濃度の調節と維持を担う。そのため、イオン輸送性膜タンパク質がその生理機能を発揮するためには適切な膜系に局在しなければならない。私達はNa^+/H^+交換輸送膜タンパク質(NHE)の活性調節タンパク質が、キネシン型微小管モーター分子(KIF1Bβ2)と結合することを見い出した。この知見から、微小管モーター分子によって、NHEの細胞内局在化が制御させていると考えられた。免疫細胞染色実験と細胞分画実験によって、KIF1Bβ2は神経シナプス小胞やリソソームなどの酸性コンパートに存在し、これらのコンパートメント上で機能するNHEの細胞内輸送に関わることが示唆された。細胞内局在化に伴うNHEの活性調節機構を明らかにするために、NHEの定量的活性測定系を開発した。これまで、NHEのイオン輸送活性は。発現細胞の耐塩力の比較や、細胞内Na^+量とH^+量を定量することによって測定されていた。そのため、特異性に欠き速度論的解析をすることが困難であった。そこで、NHE発現型酵母細胞から単離した分泌小胞と、精製組換えNHEタンパク質を組み込んだ再構成プロテオリポソームを用いて、特異的かつ定量的活性測定系を開発した。いずれの測定法も、Na^+の輸送に伴うH^+の対向輸送が観察された。さらに、その輸送量は放射性同位元素とpH指示薬を用いることによって定量的に測定された。これにより、生体膜小胞を用いた測定法と精製NHEタンパク質を用いた測定法が確立され、Na^+/H^+交換輸送を特異的かつ定量的に測定することが可能となった。

Eukaryotic cells に は extremely め て complex 雑 が な film system existence し, そ の internal は そ れ ぞ れ inherent の pH と イ オ ン concentration に bartender た れ て い る. イ オ ン conveying sex film タ ン パ ク は, double membrane lipid を interface し た イ オ ン の conveying line を い, cytoplasm や cells within the small organ の pH や イ オ ン concentration の と maintain を bear う adjustment. そ の た め, イ オ ン conveying sex film タ ン パ ク qualitative が そ の physiology を 発 swing す る た め に は appropriate に bureau な film system in し な け れ ば な ら な い. Private da は Na ^ ^ + / H + exchange transport membrane タ ン パ ク mass (NHE) の activity regulating タ ン パ ク が, キ ネ シ ン tiny tube type モ ー タ ー molecules (KIF1B beta 2) と す る こ と を see い out し た. The knowledge of <s:1> ら, microtubule モ タ タ によって molecule によって, NHE <s:1> localization が control させて ると ると ると study えられた. Immune cell staining be 験 と cells points painting be 験 に よ っ て, KIF1B beta 2 は god 経 シ ナ プ ス vesicular や リ ソ ソ ー ム な ど の acid コ ン パ ー ト に し, こ れ ら の コ ン パ ー ト メ ン ト で function on す る NHE の intracellular delivery に masato わ る こ と が in stopping さ れ た. The intracellular localized に with うNHE <s:1> activity regulatory mechanism を clear ら にするために にするために, and the quantitative activity determination of NHE <s:1> is を to develop た. <s:1> れまで, NHE <s:1> <s:1> transport activity れまで. The <s:1> salt tolerance <e:1> of the cells was compared や, the amount of Na^+ in the cells was と, the amount of H^+ was を quantitatively determined する <s:1> とによって and とによって determined されて た た. Youdaoplaceholder0 ため, specificity に is insufficient to the analysis of the <s:1> velocity theory をする であった とが is difficult であった. そ こ で, NHE 発 now type yeast cells か ら 単 from し た secretion of small cell と, refined group in え NHE タ ン パ ク qualitative を group み 込 ん だ reconstitution プ ロ テ オ リ ポ ソ ー ム を with い て, specific か つ quantitative determination of active started を 発 し た. The ずれ ずれ assay method, Na^+ <s:1> transport に accompanied by うH^+ <s:1> opposite transport が観 inspection された. Youdaoplaceholder0, そ, <s:1>, the amount of radioactive isotropic element と, pH indicator drug を, and the quantitative に determination された of さらに, る, とによって and とによって. こ れ に よ り, body small cell membrane を with い た measurement と refined NHE タ ン パ ク qualitative を with い た measurement が establish さ れ, Na + / H ^ ^ + exchange conveying を specific か つ quantitative determination of に す る こ と が may と な っ た.

项目成果

Kamauchi S, Mitsui K, Ujike S, Haga M, Nakamura N, Inoue H, Sakajo S, Ueda, Tanaka A, Kanazawa H.: "Structurally and functionally conserved domains in the diverse hydrophilic carboxy-terminal halves of various yeast and fungal Na^+/H^+ antiporters (Nha1 p

Kamauchi S、Mitsui K、Ujike S、Haga M、Nakamura N、Inoue H、Sakajo S、Ueda、Tanaka A、Kanazawa H.：“各种酵母和真菌 Na 的不同亲水性羧基末端半部中的结构和功能保守域