アポトーシス促進因子Bidの制御機構

促凋亡因子Bid的调控机制

• 批准号: 13770106
• 负责人: 木下 健
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770106/
• 关键词: アポトーシス; Bclファミリー; Bid

昨年度単離したBid結合因子(clone-2)の機能解析を進めた。1,clone-2遺伝子の発現分布をNorthern Blotで解析した。正常組織(CLONTECH社のMultiple Tissue Northern Blotを利用した)ではBrain、Liverで強いmRNAの発現を検出した。培養細胞(Cos7,Hela, HEK293,HepG2,Jurkat K562,THP1)ではHepG2細胞でやや強く、Cos7,HEK293で弱いmRNA発現を検出した。RT-PCR解析では全てのcell lineで発現が確認された。2,clone-2の安定発現細胞株の樹立を試みた。Jurkat細胞にのcDNAを組み込んだpIRES2-EGFP(CLONTECH社)ベクターを導入し、G418耐性、GFP発現を指標にclone-2の安定発現クローンを4種類得た。4クローン中2クローンがレコンビナントFasリガンドで誘導されるアポトーシスに耐性を示した。3,clone-2の細胞内局在を調べた。clone-2に対するポリクローナル抗体を作製し、HepG2細胞を免疫染色したところ、ミトコンドリアに強い染色像が見られた。HepG2細胞を分画し、western blot解析したところ、ミトコンドリアを含むheavy membrane画分にclone-2のカルボキシ末端側とみられる14kDaのバンドを検出した。clone-2の全長に相当する蛋白のバンドは確認できなかった。4,アンチセンスRNA発現ベクター導入による内在性clone-2の発現阻害を試みたが、14kDaのバンドの消失は認められなかった。以上の結果より、過剰発現系においてはclone-2がBidで誘導されるアポトーシスに対して抑制的に働く可能性が示唆された。

A functional analysis of the clone-2 factor. Northern Blot analysis of 1,clone-2 gene. Multiple Tissue Northern Blot (CLONTECH) is used to detect mRNA expression in Brain and Liver tissues. Cultured cells (Cos7,Hela, HEK293,HepG2,Jurkat K562, THP1) showed strong mRNA expression in HepG2 cells and weak mRNA expression in Cos7 and HEK293 cells. RT-PCR analysis confirmed the presence of complete cell lines. 2,clone-2 stable development cell line was established. Jurkat cells contain cDNA for pIRES2-EGFP(CLONTECH), and four kinds of cDNA for clone-2 and GFP expression are obtained. 4. The resistance of the two groups to induction is shown. 3,clone-2 is in the middle of the cell. clone-2 antibody was produced and HepG2 cells were immunostained. HepG2 cells were analyzed by Western blot analysis, including heavy membrane analysis, clone-2 analysis, and 14kDa analysis. Clone-2 is a full-length protein equivalent that can be identified by DNA sequencing. 4. The intrinsic clone-2 gene expression inhibition test was conducted during the introduction of 14kDa RNA. The above results show that clone-2 is induced to inhibit the occurrence of virus infection.