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酸化的DNA損傷を認識する新規な修復酵素の精製とキャラクタリゼーション

识别氧化 DNA 损伤的新型修复酶的纯化和表征

基本信息

批准号：
02J00638
负责人：
正岡綾
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Osaka Prefecture University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

5-ホルミルウラシル(fU)は電離放射線や活性酸素によりチミンから生成する主要な酸化損傷である。同損傷は電子吸引性のホルミル基の影響でイオン化が起こりDNA複製の際、本来の対合塩基であるアデニンだけでなく誤ったグアニンとも対合するため突然変異性を示す。これまでに、fU修復活性を持つ酵素として大腸菌ではAlkAを、真核生物ではSMUG1を同定した。本年度は昨年度に引き続き、SMUG1抗体による中和実験で残留活性が認められた5-ヒドロキシウラシル(hoU)の修復活性の精製を試みた。hoUを部位特異的に含むオリゴヌクレオチド基質を^<32>P標識し、二本鎖とした後、HeLa細胞粗抽出物とインキュベートした。反応生成物はポリアクリルアミド電気泳動により分析した。hoU特異的な活性が存在すると基質オリゴヌクレオチドの切断バンドが得られるので、これを酵素精製の指標とした。近年、大腸菌エンドヌクレアーゼVIIIのホモログとしてヒトNEIL1およびNEIL2が同定されたが、これら酵素の基質特異性に関して相反した報告がある。そこで、現精製段階にあるhoU修復活性がNEIL1およびNEIL2に由来するか検討するために、APサイトおよび酸化損傷を含むオリゴヌクレオチド基質を用いて、各基質に対する酵素活性を比較検討した。その結果、_NEIL1はhoUやAPサイトをよく認識すること、またNEIL2はAPサイトを主に認識することが明らかとなった。そこで、NEIL1およびNEIL2の抗体を作製し、現精製段階にあるhoU修復活性の中和実験を行った。しかし、抗体による活性中和は認められず、上記活性がNEIL1に由来しないことを確認した。これまでに、カラムクロマトグラフィーにより精製した活性をSDSゲル電気泳動により分離し、タンパク質バンドを切り出した後、TOF-MS質量分析により測定したが、同定には至っていない。

5-fluorouracil (fU) is the main acid damage caused by ionizing radiation and active acid. The effect of electron attractivity on DNA replication and its natural interaction was studied. The activity of fU repair in E. coli is similar to that in eukaryotes. This year, the purification of the 5-terminal antibody (hoU) for SMUG1 antibody was tested. HoU is a site-specific protein that contains a protein that can be used to identify, isolate, <32>and isolate HeLa cells. The reaction products were analyzed by electrophoresis. HoU specific activity is present in the matrix and is an indicator of enzyme purification. In recent years, E. coli has been reported to have the same activity as NEIL-1 and NEIL-2, while the substrate specificity of E. coli has been reported to be opposite. The enzyme activity of NEIL-1 and NEIL-2 was compared between the enzyme activity of NEIL-1 and NEIL-2 in the medium containing NEIL-1 and NEIL-2. Results: NEIL1, NEIL2, and AP are recognized. NEIL1 and NEIL2 antibody production, purification stage, hoU repair activity and neutralization The activity of NEIL1 is confirmed by the antibody neutralization. This is the first time that a sample has been analyzed by TOF-MS mass spectrometry.