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クライオ電子顕微鏡法によるセルロース合成酵素の立体構造解析

使用冷冻电子显微镜对纤维素合酶进行三维结构分析

基本信息

批准号：
02J01006
负责人：
今井友也
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.本研究課題の目的は、セルロース合成酵素の機能をその構造から明らかにすることにある。電子顕微鏡による単粒子構造解析を目指して、酢酸菌からセルロース合成酵素の単離精製実験を既報に従い行ってきたが、成功していない。そこで異種発現系の構築を目指してセルロース合成酵素オペロンのクローニングを行うべく、プライマー設計まで行った。また合成酵素の単離を生化学的に追跡する手段がないため、ポリクロ抗体の作製を外注にて行っている。セルロース合成酵素(BcsA遺伝子産物)そのものに加えて、同一オペロンに存在するBcsC遺伝子産物の追跡を開始すべく、これに対する抗体も作製依頼中である。2.セルロースも含めて多糖分子の合成酵素を考える際に、糖転移反応に関する酵素学的な視点は大きく取り上げられてきたが、ミクロフィブリルなどの高次構造を形成する機構の具体的な認識が乏しいという問題点を、多糖の合成例の比較から指摘した(第6回理研シンポジウム「高分子結晶の構造と機能」において発表)。3.二次元結晶化によるタンパク構造解析は、膜タンパクの構造解析として非常に有用であることが示されつつある。しかしX線結晶解析用の三次元結晶と対照的に、二次元結晶作製の方法論は確立されたものではない。将来的にセルロース合成酵素の高分解能解析のためには必須であろう二次元結晶解析を見据え、あるバクテリア由来の膜タンパク質を用いて二次元結晶化の方法論の確立を目指して実験を開始した。現在まで、脂質二重層内に再構成された構造物をコンスタントに得られるようになったが、まだ結晶性が弱く解析に値するものは得られていない。それでも精製・結晶化の間に静電作用を抑える戦略が重要であることが分かりつつある。

1. The purpose of this study is to construct a functional framework for enzyme synthesis. Electron microscope analysis of the structure of the individual particles was carried out successfully. The construction of heterogeneic development system is indicated by the enzyme selection and design. Biochemistry of synthetic enzymes is the key to the production of antibodies. The detection of BcsC gene product in the presence of BcsA gene and the detection of BcsC gene product in the presence of BcsA gene in the presence of BcsA gene and BcsC gene in the presence of BcsA gene are discussed in detail. 2. The enzyme synthesis of polysaccharide-containing molecules is studied in detail from the perspective of enzymology. The structure of polysaccharide-containing molecules is formed in higher order. The specific understanding of polysaccharide-containing molecules is insufficient. The problem is that the synthesis of polysaccharide-containing molecules is relatively criticized (Chapter 6,"Structure and function of polymer crystals"). 3. Two-dimensional crystallization is very useful for structural analysis. The methodology of three-dimensional and two-dimensional crystallization for X-ray crystallographic analysis has been established. In the future, it is necessary to establish a methodology for the analysis of high decomposition energy of synthetic enzymes by two-dimensional crystallization. Now, the structure of the lipid double layer is composed of two parts: one part is crystalline, the other part is crystalline. It is important to suppress electrostatic interaction between refining and crystallization.