cDNAアレイ法を用いた真核型無機炭素輸送体遺伝子の単離と機能解析

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(1)CO_2応答に必須な調節因子CCM1について、亜鉛フィンガー候補領域に亜鉛を結合しているかを明らかにするため、この領域をGST融合タンパク質として大腸菌で発現させて精製した。亜鉛の定量を行なったところ、亜鉛フィンガー領域とは約1:1の割合で亜鉛が結合していた。さらに、亜鉛フィンガードメインに含まれるAsp-60残基がCCM1の機能に必須であるかどうかを検証するため、これをHis、Cys、Valにそれぞれ置換した株を作出したところ、いずれの形質転換株もCO_2欠乏条件下で野生型と同様に生育したことから、Asp-60以外の残基に亜鉛が結合していることが推定された。一方、カルボキシ末端の54アミノ酸残基を欠損するとCO_2欠乏による転写誘導が起こらなかったので、この領域は転写誘導に必須であることが明確になった。(2)抗CCM1抗体を作成して、ウェスタン解析を行なったところ、クラミドモナスの可溶性画分に、約95kDaのタンパク質を検出した。CCM1タンパク質の推定分子量は70,073であるので、CCM1はin vivoで何らかの修飾を受けていることが示唆された。さらに、CCM1タンパク質はCO_2濃度に関わりなく構成的に発現しており、細胞内では高分子複合体を形成していると推定された。(3)無機炭素輸送体の実体については複数の候補遺伝子についてRNAi法による機能解析を更に進める予定である。