プロテインスプライシングを用いた生物個体内での蛋白質の構造変化検出法の開発

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蛋白質間相互作用を生細胞内において時空間解析可能にするRenilla luciferaseをスプリットさせて用いる生物発光検出法を開発し,インスリンシグナル経路における蛋白質間相互作用,細胞内のCa^<2+>依存的な蛋白質間相互作用,および乳癌細胞内におけるMAPK経路の蛋白質の二量体形成過程を検出することにより,相互作用依存的な即時一過性の生物発光が検出可能であることを示した.特に,本年度の研究においては,本方法を用いて,成長,分化,癌化などに関わる重要な細胞内シグナルの最下流の蛋白質MAPK (mitogen activated kinase)の一つであるERK2 (extracellular regulated kinase 2)の二量体形成過程を検出した.ERK2は様々な情報伝達経路を介してThreonineとTyrosineがリン酸化されることにより活性化する.リン酸化したERKは二量体を形成し迅速に核内移行し,蛋白質の発現を調整する様々な蛋白質を基質としてリン酸化することで,細胞の分化,成長,癌化を制御している.従来の方法では,その二量体形成過程を検出することは不可能であった.N末側Renilla luciferaseに2つのERK2を介してC末側Renilla luciferaseを直列に連結させた融合蛋白質を作製した.ERK2の二量体の形成によりRenilla luciferaseのN末とC末が近接し発光酵素活性を回復する.本新規方法を導入した人乳癌細胞MCF-7細胞を血清非存在下で培養しERK2を非活性化した後,表皮成長因子(EGF)を添加したところ,ERK2の二量体形成に伴う生物発光強度の増大が確認できた。ERK2の二量体形成過程を生物発光により可視化する本研究は,ERK2のリン酸化をWestern Blottingにより検出する従来法とは異なり,MAPKの活性化による蛋白質発現調節機構に対して多くの新規知見を得ることが期待できる.