転写因子としてのポリADPリボース合成酵素(PARP)の役割の解明

研究代表者は、インスリン産生細胞再生増殖因子であるRegの発現はReg遺伝子の転写誘導によること、またその転写誘導は、ポリADPリボース合成酵素(PARP)が転写因子としてReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に特異的に結合し、その他複数の因子をリクルートし転写複合体を形成することで引き起こされることを明らかにした。そこで本研究ではPARPが転写因子として機能する際にPARP蛋白のどのドメインがReg遺伝子プロモーター領域に特異的に結合して機能しているのかを明らかにすることで、転写因子としてのPARPによる遺伝子発現機構を解明する。平成16年度の研究は以下のように進行した。1.前年度にリコンビナントPARP、野生型(558 unit/mg,711μg)、HAタグ付野生型(570 unit/mg,621μg)、zinc figer motif変異型(154 unit/mg,190μg)を得た。これらの精製蛋白質等を用いて、Electromobility Shift Assay(EMSA法)で、Reg promoter領域への配列特異的結合を検討した。2.野生型PARPはラットReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に特異的に結合した。DNA probeに一塩基ずつ変異を導入したcold competitorを用いてEMSA法を行い、PARPの結合認識配列を検討したところ、GC box類似の配列5'-TGCCCTCCCAT-3'において下線で示す塩基がPARPの結合に必須の塩基配列であることを明らかになった。また、この配列はラット、マウス、ヒトのReg遺伝子プロモーター領域においてよく保存されていた。3.zinc finger motif変異型PARPはReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に対して結合活性を示したが、結合に上述の配列特異性が失われていた。野生型PARPにおける配列特異的な結合にzinc finger motifが関与していることが示された。

研究代表者は、インスリン産生細胞再生増殖因子であるRegの発現はReg遺伝子の転写誘導によること、またその転写誘導は、ポリADPリボース合成酵素(PARP)が転写因子としてReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に特異的に結合し、その他複数の因子をリクルートし転写複合体を形成することで引き起こされることを明らかにした。そこで本研究ではPARPが転写因子として機能する際にPARP蛋白のどのドメインがReg遺伝子プロモーター領域に特異的に結合して機能しているのかを明らかにすることで、転写因子としてのPARPによる遺伝子発現機構を解明する。平成16年度の研究は以下のように進行した。1.前年度にリコンビナントPARP、野生型(558 unit/mg,711μg)、HAタグ付野生型(570 unit/mg,621μg)、zinc figer motif変異型(154 unit/mg,190μg)を得た。これらの精製蛋白質等を用いて、Electromobility Shift Assay(EMSA法)で、Reg promoter領域への配列特異的結合を検討した。2.野生型PARPはラットReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に特異的に結合した。DNA probeに一塩基ずつ変異を導入したcold competitorを用いてEMSA法を行い、PARPの結合認識配列を検討したところ、GC box類似の配列5'-TGCCCTCCCAT-3'において下線で示す塩基がPARPの結合に必須の塩基配列であることを明らかになった。また、この配列はラット、マウス、ヒトのReg遺伝子プロモーター領域においてよく保存されていた。3.zinc finger motif変異型PARPはReg遺伝子プロモーター領域のGC box類似配列に対して結合活性を示したが、結合に上述の配列特異性が失われていた。野生型PARPにおける配列特異的な結合にzinc finger motifが関与していることが示された。