中枢神経系におけるミエリン形成機構解明に関する研究

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ミエリンの形成過程をゼブラフィッシュの生体外から記録するために、オリゴデンドロサイトに特異的なP0蛋白のプロモーターを利用してGFPを発現させることで、オリゴデンドロサイトのみをラベル、これにより細胞の形態・ミエリン形成を観察することが可能になる。免疫染色等からP0蛋白はゼブラフィッシュのミエリン形成を開始する前のオリゴデンドロサイトの細胞体および細胞突起に豊富に発現し、ミエリン形成過程を追跡するためのマーカーとして有用であることを確認。さらにプロモーターコントロールのもとでGFPを発現させる目的でDNA constructの作成に着手。zebrafish BAC libraly screeningよりzebrafish P0 BAC CLONEを入手、制限酵素切断の後、self ligationしたサンプルより配列を解析。その結果exonIII,IV,V付近の構造は判明したが,それよりも上流のexon, intron構造に関しては解析が及ばなかった。既知のゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAより5'側領域の配列をもとにプライマーを設定、zebrafish P0 BAC CLONEからプロモーター領域を含むと思われるサンプルをPCR法によりscreening、subcloningし、P0蛋白の上流に位置すると考えられる1〜6kbの数種のサンプルを得た。これらのサンプルをプロモーター領域を持たないGFPにhomologus recombinationによってcloningし、1〜4細胞期のゼブラフィッシュ胚にinjectし発現解析することでプロモーター領域を含むfragment,および領域の同定した。また発現解析時の発現部位の確認のためのコントロールとしてゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAの全長をcloningすることを目的としてzebrafish cDNA libralyを作成した。