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中枢神経系におけるミエリン形成機構解明に関する研究

阐明中枢神经系统髓磷脂形成机制的研究

基本信息

批准号：
02J10545
负责人：
秋葉陽介
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ミエリンの形成過程をゼブラフィッシュの生体外から記録するために、オリゴデンドロサイトに特異的なP0蛋白のプロモーターを利用してGFPを発現させることで、オリゴデンドロサイトのみをラベル、これにより細胞の形態・ミエリン形成を観察することが可能になる。免疫染色等からP0蛋白はゼブラフィッシュのミエリン形成を開始する前のオリゴデンドロサイトの細胞体および細胞突起に豊富に発現し、ミエリン形成過程を追跡するためのマーカーとして有用であることを確認。さらにプロモーターコントロールのもとでGFPを発現させる目的でDNA constructの作成に着手。zebrafish BAC libraly screeningよりzebrafish P0 BAC CLONEを入手、制限酵素切断の後、self ligationしたサンプルより配列を解析。その結果exonIII,IV,V付近の構造は判明したが,それよりも上流のexon, intron構造に関しては解析が及ばなかった。既知のゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAより5'側領域の配列をもとにプライマーを設定、zebrafish P0 BAC CLONEからプロモーター領域を含むと思われるサンプルをPCR法によりscreening、subcloningし、P0蛋白の上流に位置すると考えられる1〜6kbの数種のサンプルを得た。これらのサンプルをプロモーター領域を持たないGFPにhomologus recombinationによってcloningし、1〜4細胞期のゼブラフィッシュ胚にinjectし発現解析することでプロモーター領域を含むfragment,および領域の同定した。また発現解析時の発現部位の確認のためのコントロールとしてゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAの全長をcloningすることを目的としてzebrafish cDNA libralyを作成した。

The formation process of P0 protein in vitro was recorded by GFP, and the formation of P0 protein in vitro was observed by GFP. Immunostaining and other methods to detect the P0 protein in the cell body and cell processes before the start of the protein formation were used to trace the protein formation process. The goal of GFP discovery is to create a DNA construct. zebrafish BAC library screening As a result, exonIII,IV,V structures were identified, and the upper exon, intron structures were analyzed. It is known that the cDNA sequence of P0 protein in the 5'side region is set up, zebrafish P0 CLONE is set up, and PCR is used to screen, subclone, and locate the upstream of P0 protein. In this case, the GFP homolog recombination was performed at the 1 ~ 4 cell stage, and the GFP homolog recombination was performed at the same time. The full-length cDNA of P0 protein was cloned and the zebrafish cDNA library was prepared.