5-ハロウラシルの光反応性を利用したZ型DNAの生物学的役割の解明

利用 5-卤尿嘧啶的光反应性阐明 Z 型 DNA 的生物学作用

基本信息

批准号：
02J10982
负责人：
大吉崇文
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Tokyo Medical and Dental University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J10982/
关键词：
ハロウラシル光反応 Z型DNA ADARI DNA結合タンパク Zのタンパク 8-Xチルグアニン 5-ヨードウラシル RNA編集 5-ハロウラシル DNA局所構造 Zαタンパク C2'α位水酸化体

项目摘要

DNAの構造は遺伝子発現など様々な過程で局所的に構造が劇的に変化することが考えられている。局所構造の中でも左巻きのZ型DNAは詳細に研究されているが、生物学的役割については不明なままである。その理由は生きた細胞内のDNAの局所構造を正しく検出することが困難であることが挙げられる。これまでに5-ハロウラシルを含むDNAの光反応性は。DNAの構造によって特徴的に変化することが見いだされている。そこで我々は細胞内のZ型DNAの検出をめざして、ADARIのN末領域に存在するDNA結合領域であるZαタンパク用い、それによって誘起されたZ型DNA内での5-ヨードウラシルの光反応性を詳細に調べた。用いたDNAはZ型構造を誘起する8-メチルグアニン(m^8G)を含むオリゴヌクレオチドd(Cm^8GCAm^8GCG)と、これに対して相補的なオリゴヌクレオチドであり5-ヨードウラシル(^IU)を含むd(CGCG^IUGCG)との2本鎖オリゴヌクレオチドである。Zαタンパク存在下においてこのオリゴマーはZ型構造をとることをCDスペクトルにより確認した。更にこの複合体の光反応性を調べたところ、5-ヨードウラシルの5'側に近接するグアニンがC2'α位の水酸化体になった生成物d(CGC)rG(UGCG)が得られた。d(CGC)rG(UGCG)をリボヌクレアーゼT1処理によって生成するd(UGCG)はZαタンパクによって誘起されるZ型構造の比と一致することが明らかとなった。以上の結果より5-ハロウラシルの光化学反応とその後の酵素分解を組み合わせることによって、生じるZ型DNA領域を検出することが原理的に可能であることが示された。生細胞中のDNAに5-ハロウラシルを取り込ませることは容易である。本検出法では細胞透過性のある光照射を用いるので生きた細胞にも適用でき、Z型構造領域が特定の遺伝子発現が起こる際に短時間出現するような場合にも利用できることが示された。

据认为，DNA的结构在各种过程中局部发生了巨大变化，例如基因表达。在局部结构之间已经详细研究了左手Z型DNA，但其生物学作用仍然未知。原因是很难正确检测活细胞内DNA的局部结构。到目前为止，已经实现了含有5-途的DNA的光反应性质。已经发现它是由DNA的结构特征改变的。因此，为了检测细胞中的Z型DNA，我们使用了Zα蛋白，Zα蛋白是ADARI N末端区域中存在的DNA结合区域，并详细研究了由此引起的Z-Type DNA中5-碘的光反应性。使用的DNA是寡核苷酸D（CM^8GCAM^8GCG）的双链寡核苷酸，其中含有8-甲基鸟嘌呤（M^8G），可诱导Z型结构，辅助性核苷酸和辅助性的寡核苷酸，d（cgcg^iugcg^iugcg）含5-- iodior（cgcg^iugcg）。 CD光谱证实，在存在Zα蛋白的情况下，低聚物具有Z型结构。此外，还研究了该复合物的光反应性，并获得了与5-碘的5'侧相邻的鸟嘌呤在C2'α位置成为羟基化产物的产物D（CGC）RG（UGCG）。结果表明，核糖核酸酶T1治疗产生的D（CGC）RG（UGCG）与Zα蛋白诱导的Z型结构的比率相吻合。以上结果表明，原则上可以通过将5-甲拉西尔的光化学反应与随后的酶促降解相结合来检测所得的Z型DNA区域。在活细胞中，将5-途径掺入DNA中很容易。这种检测方法使用可渗透的光照射，因此可以应用于活细胞，并且已证明它可以在发生特定基因表达的短时间内出现Z型结构区域的情况下使用。