N,N'-ジアセチルキトビオース受容体タンパク質の基質認識機構の解明

N,N-二乙酰壳二糖受体蛋白底物识别机制的阐明

• 批准号: 02J20027
• 负责人: 齋藤 明広
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: National Institute of Agrobiological Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J20027/
• 关键词: 受容体タンパク質; ABC輸送系; キチン分解産物; 放線菌; 結晶構造解析; ELISA; 糖質認識; 基質特異性

1)NgcEタンパク質の結晶構造解析.平成14年度に大量発現系と精製系を確立したNgcEタンパク質(N-アセチルグルコサミンおよびN,N'-ジアセチルキトビオース結合タンパク質)について,結晶化条件の検討を行った.その結果,条件の1次,二次スクリーニングを経て,2.1Aの解像度でX線の反射をする質の良い結晶を得ることができた.また,大腸菌メチオニン要求性変異株を用いて,メチオニン残基をセレノメチオニンで置き換えたNgcEタンパク質を過剰発現し,精製した.セレノメチオニンでラベルされたNgcEタンパク質の結晶が類似条件下で得られ,2.0Aの解像度の反射を得た.2)キトビオース結合タンパク質活性測定系の確立.ABC輸送系の受容体タンパク質の基質特異性を調べるための簡便法として,ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)に基づいた方法の確立を行った.基質は,N,N'-ジアセチルキトビオース{(GlcNAc)_2}あるいはN,N',N''-テトラアセチルキトトリオース{(GlcNAc)_3}の還元末端をAPEA(aminophenylethylamine)のエチルアミノ基と反応させ、その後,得られたAPEA誘導体のアミノフェニル基とBSA(牛血清アルブミン)中のアミノ基とをグルタルアルデヒドをリンカーとしてカップリングすることによって合成した.BSAへのGlcNAc残基の導入の確認は,WGA(wheat germ agglutinin:GlcNAc残基を特異的に認識するレクチン)を用いて行った.本方法の有効性を,既に基質特異性がプラズマ共鳴装置を用いて決定されているNgcEタンパク質を用いて検討したところ,これらの基質を用いた測定方法が,基質特異性の決定に有効であることが確認された.

1) Analysis of the crystalline structure of NgcEタ パ パ in the benign globulin. Pp.47-53 14 year に large 発 now series と refined を establish し た NgcE タ ン パ ク mass (N - ア セ チ ル グ ル コ サ ミ ン お よ び N, N '- ジ ア セ チ ル キ ト ビ オ ー ス combining タ ン パ ク qualitative) に つ い て, crystallization conditions の 検 line for を っ た. そ の as A result, the condition of の, secondary ス ク リ ー ニ ン グ を 経 て, 2.1 A の resolutions で X-ray の reflection を す る good quality の い crystallization を must る こ と が で き た. ま た, coliform メ チ オ ニ ン - different strains を sex with い て, メ チ オ ニ ン residues を セ レ ノ メ チ オ ニ ン で buy き in え た NgcE タ ン パ ク qualitative を through turning 発 し, refined し た. セ レ ノ メ チ オ ニ ン で ラ ベ ル さ れ た NgcE タ ン パ ク の crystallization が similar Under certain conditions, で gives られ, and the 2.0A <s:1> resolution <e:1> reflection を gives た.2) the キトビ <s:1> <s:1> ス ス ス combined with the タ パ パ パ パ activity determination system を is established. ABC conveying is の be let body タ ン パ ク qualitative の substrate specificity を adjustable べ る た め の is simple method と し て, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) に base づ い た method の line established を っ た. Matrix は, N, N '- ジ ア セ チ ル キ ト ビ オ ー ス {(GlcNAc) _2} あ る い は N, N', N '- テ ト ラ ア セ チ ル キ ト ト リ オ ー ス {(GlcNAc) _3} の is yuan end を APEA (aminophenylethylamine) の エ チ ル ア ミ ノ base と anti 応 さ せ, そ の , when ら れ た APEA inductor の ア ミ ノ フ ェ ニ ル base と BSA (bovine serum ア ル ブ ミ ン) in の ア ミ ノ base と を グ ル タ ル ア ル デ ヒ ド を リ ン カ ー と し て カ ッ プ リ ン グ す る こ と に よ っ て synthetic し た. BSA へ の GlcNAc residues の import の confirm は, WGA (wheat germ agglutinin:GlcNAc residue を specific に recognition するレ チ チ を を use て て lines った. を の have sharper, this method is both に substrate specificity が プ ラ ズ マ を echo mechanism with い て decided さ れ て い る NgcE タ ン パ ク qualitative を with い て beg し 検 た と こ ろ, こ れ ら を の matrix with い た が determination method, substrate specificity の decisions have sharper に で あ る こ と が confirm さ れ た.

项目成果

Saito A, Fujii T, Miyashita K.: "Distribution and evolution of chitinase genes in Streptomyces species : involvement of gene-duplication and domain-deletion."Antonie van Leeuwenhoek. 84. 7-16 (2003)

Saito A、Fujii T、Miyashita K.：“链霉菌中几丁质酶基因的分布和进化：基因复制和结构域删除的参与。”Antonie van Leeuwenhoek。

Saito A, Schrempf H.: "Mutational analysis of the binding affinity and transport activity for N-acetylglucosamine mediated by the novel ABC transporter Ngc within the chitin-degrader Streptomyces olivaceoviridis."Molecular Genetics and Genomics.. 印刷中.

Saito A，Schrempf H.：“几丁质降解剂橄榄绿链霉菌中新型 ABC 转运蛋白 Ngc 介导的 N-乙酰氨基葡萄糖的结合亲和力和转运活性的突变分析。”分子遗传学和基因组学。正在出版。