心筋発生分化の分子機構の解明

本研究は、マウスES細胞を用いて心筋細胞への分化制御機構の解明をめざし、心筋幹細胞特異的な選択マーカー及び心筋分化誘導因子の単離を行なおうとするものである。前年度までは分泌性シグナル因子Wnt11に着目し、Wnt11がES細胞の心筋分化に大きな影響を与える因子であることを明らかにした。本年度は、未知の心筋の発生・分化に関わる因子の探索を目的とし、まず、血清除去処理によりES細胞由来の胚様体の心筋分化誘導が促進されることを見出した。また、この分化誘導法により培養した分化7日目の胚様体を用いてDNAマイクロアレイ解析を行い、血清除去により発現が変化する遺伝子群を同定し、CACHE(Cardiogenesis Associated genes from CHip assay of EBs)の候補とした。この中の一つ、CACHE20は細胞内シグナル伝達系に関わるアダプタータンパク質をコードするものであることが明らかとなった。In situ hybridization法により同遺伝子の発現部位を検討したところ、CACHE20の発現はマウス9.5日胚の心臓で観察された。ES細胞由来の胚様体におけるRNA発現の時間経過の検討では、CACHE20は分化4日目以降に発現量が増加し、5日目に最大となり、レチノイン酸処理により心筋分化を抑制した胚様体では発現が抑制されていた。さらに、RNAi法によりCACHE20の発現をノックダウンしたES細胞を作成したところ、分化8日後に拍動する胚様体の割合が減少していた。また、このCACHE20ノックダウンES細胞由来の胚様体からRNAを調製し、定量的RT-PCRによる発現検討を行ったところ、未処理ES細胞に比して、心筋構造タンパク質をコードする遺伝子のRNA発現量の減少を認めた。これらの結果から、CACHE20は心臓発生に重要な役割を有することが示唆された。

本研究は、マウスES細胞を用いて心筋細胞への分化制御機構の解明をめざし、心筋幹細胞特異的な選択マーカー及び心筋分化誘導因子の単離を行なおうとするものである。前年度までは分泌性シグナル因子Wnt11に着目し、Wnt11がES細胞の心筋分化に大きな影響を与える因子であることを明らかにした。本年度は、未知の心筋の発生・分化に関わる因子の探索を目的とし、まず、血清除去処理によりES細胞由来の胚様体の心筋分化誘導が促進されることを見出した。また、この分化誘導法により培養した分化7日目の胚様体を用いてDNAマイクロアレイ解析を行い、血清除去により発現が変化する遺伝子群を同定し、CACHE(Cardiogenesis Associated genes from CHip assay of EBs)の候補とした。この中の一つ、CACHE20は細胞内シグナル伝達系に関わるアダプタータンパク質をコードするものであることが明らかとなった。In situ hybridization法により同遺伝子の発現部位を検討したところ、CACHE20の発現はマウス9.5日胚の心臓で観察された。ES細胞由来の胚様体におけるRNA発現の時間経過の検討では、CACHE20は分化4日目以降に発現量が増加し、5日目に最大となり、レチノイン酸処理により心筋分化を抑制した胚様体では発現が抑制されていた。さらに、RNAi法によりCACHE20の発現をノックダウンしたES細胞を作成したところ、分化8日後に拍動する胚様体の割合が減少していた。また、このCACHE20ノックダウンES細胞由来の胚様体からRNAを調製し、定量的RT-PCRによる発現検討を行ったところ、未処理ES細胞に比して、心筋構造タンパク質をコードする遺伝子のRNA発現量の減少を認めた。これらの結果から、CACHE20は心臓発生に重要な役割を有することが示唆された。