細胞内の脂質セカンドメッセンジャーの蛍光プローブ分子

细胞内脂质第二信使的荧光探针分子

• 批准号: 13740419
• 负责人: 佐藤 守俊
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13740419/
• 关键词: 脂質セカンドメッセンジヤー; 蛍光プローブ; ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸; 蛍光共鳴エネルギー移動; エンドサイトーシス; GFP; PIP_3; FRET; 脂質セカンドメッセンジャー; 細胞内情報伝達; 蛍光プローブ分子; DAG; PIP3; CFP; YFP

細胞内の主要な脂質セカンドメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸(PIP_3)を,蛍光顕微鏡下の単一細胞で可視化分析するために新規蛍光プローブ分子(fllip:フリップ)を開発した.FllipはPIP_3と結合するドメイン(LBD:Lipid binding domain)とオワンクラゲ由来の緑色蛍光蛋白質の2つの異色変異体(シアン色蛍光蛋白質と黄色蛍光蛋白質)からなる.このfllipは蛋白質からなる蛍光プローブ分子なので,まずfllipをコードするcDNAを作成し,培養細胞に導入したところ半日程度で細胞から蛍光が観察されfllipが蛋白質発現されたことが分かる.Fllipに特定の膜局在化アミノ酸配列を連結すると,fllipを細胞内の特定局所膜系にのみ配置でき,これによりそれぞれの特定の膜系におけるPIP_3の量的変化を可視化できる期待できた.本研究では細胞膜(形質膜)と,小胞体膜・ゴルジ体膜にfllipを配置し,PIP_3の濃度変化を追跡した.これにより,1)血小板由来成長因子(PDGF)などのペプチドホルモン刺激により,PIP_3が細胞膜のみならず小胞体膜やゴルジ体膜などendomembraneで大量に増加することを見いだした.また,2)このendomembraneでのPIP_3は,エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたチロシンキナーゼ受容体に刺激されてendomembrane上で生合成されたものであることを明らかにした.本法はPIP_3のみならずその他の脂質セカンドメッセンジャーにも応用可能な一般的方法論である.例えば脂質セカンドメッセンジャーと結合するLBDを選ぶことにより,ジアシルグリセロールやホスファチジルイノシトール-3-一リン酸を検出する蛍光プローブへとテーラーメイドできる.また,fllipに連結した膜局在化アミノ酸配列を選ぶことにより,本研究で示した細胞膜,小胞体膜,ゴルジ体膜のみならず,核膜,ミトコンドリア膜など各種オルガネラ膜における脂質セカンドメッセンジャーを選択的に可視化検出できると期待される.

The main Lipid binding domain (LBD) and the origin of green fluorescent protein 2 and its heterochromes (colorless fluorescent protein and yellow fluorescent protein) were analyzed visually in single cells under microscope. The fllip protein is expressed in a protein sequence, and the fllip protein is expressed in a protein sequence. The fllip protein is expressed in a protein sequence. The fllip protein is expressed in a protein sequence. The fllip protein is expressed in a protein sequence. The amount of PIP_3 in the membrane system is visualized. In this study, the concentration of PIP_3 in plasma membrane was investigated. 1) Platelet-derived growth factor (PDGF) increases in the plasma membrane and the somatic membrane of the cell when stimulated by PIP3. 2) PIP_3 in the endomembrane is produced by intracellular stimulation in the endomembrane. This method can be applied to the general methodology of PIP_3 and other lipids. For example, the LBD of lipid is selected from the group consisting of lipid, lipid and 3-hydroxy acid. In this study, we show that cell membrane, small cell membrane, somatic membrane, nuclear membrane, tri-membrane, lipid membrane, lipid