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生きた細胞内のG蛋白質情報伝達の活性化を可視化する蛍光プローブ分子

荧光探针分子可可视化活细胞中 G 蛋白信号传导的激活

基本信息

批准号：
15655023
负责人：
佐藤守俊
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15655023/
关键词：
G蛋白質 GPCR エフェクター蛍光プローブ FRET

项目摘要

本研究の目的は,生きた細胞において最も主要な情報伝達の一つであるG蛋白質情報伝達を可視化検出する新規蛍光プローブ分子を開発し,蛍光顕微鏡下の単一細胞内の情報伝達を分析することである.昨今のゲノム解析(ヒト遺伝子総数は2-3万)により,G蛋白質連結型受容体(G-protein coupled receptor; GPCR)は1000種類にも及ぶ巨大な遺伝子ファミリーを形成しており,それぞれが,グルタミン酸・ドーパミンなど多くの神経伝達物質,ペプチド及びステロイドホルモン,嗅覚物質,味覚物質など受容体であることが明らかになっている.この1000種類に及ぶGPCRはGq, Gs, GiのいずれかのG蛋白質に結合しており,リガンド依存的に,対応するG蛋白質を活性化して,この活性化したG蛋白質がさらに下流の蛋白質(エフェクター)と結合しその活性をコントロールする.従って,G蛋白質とエフェクター蛋白質との相互作用を検出するFRET型の蛍光プローブを開発すれば当該目的を達成できると考えた.まずGqの活性化を検出するプローブをデザイン,それをコードするcDNAを遺伝子工学的手法を用いて作製した.このcDNAを生きた細胞内に導入してプローブ蛋白質を発現させ,この細胞をリガンド刺激して得られるFRET応答を指標にプローブの評価を行った.Gqについて多数のプローブデザインを評価・検討し,大きくFRET応答を示す蛍光プローブを見出した.この蛍光プローブが,生細胞内でアセチルコリン受容体など種々のGq連結型GPCRの活性化を可視化できることを示した(投稿準備中).さらに,GsおよびGiプローブを開発した(投稿準備中).これらGq, Gs, Giの三種類のプローブをそれぞれ用いることにより,上述の神経伝達物質,ペプチドホルモンのGPCRの活性化はもちろんのこと,生理的リガンドが未発見のorphan GPCRの活性化をも可視化できると考えている.

The purpose of this study is to develop new methods for visualizing and analyzing the information transmission of G protein in living cells. Today's G-protein coupled receptor (GPCR) has more than 1000 species and at least 1000 large GPCR receptors. These 1000 species and at least GPCRs bind to Gq, Gs, Gi and G2 proteins, and activate G-protein binding to Gq, Gs, Gi proteins. The interaction between G protein and protein is detected, and FRET type light source is developed. The activation of Gq is controlled by cDNA engineering. The cDNA is introduced into the cell, the protein is produced, the cell is stimulated, and the FRET response is evaluated.Gq is used to evaluate most of the FRET response. The activation of Gq-linked GPCR is visualized in the host cell (submission preparation). Today,Gs and Gi are opening up (submission preparation). The three types of Gq, Gs, Gi are used in the visualization of the activation of the GPCR, the physiological activation of the GPCR, and the physiological activation of the GPCR.