有用単鎖抗体遺伝子の生体外大規模発現検索システムの構築

有用单链抗体基因体外大规模表达搜索系统的构建

• 批准号: 13750734
• 负责人: 河原崎 泰晶
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13750734/
• 关键词: 無細胞蛋白質合成系; 小麦胚芽抽出液; 単鎖抗体; ヒト血清アルブミン; 高速多検体検索系; 進化工学的機能改良; カルボキシペプチダーゼ; アフィニティータグ; 大規模発現検索; scFv; 進化工学的機能改変; ハイスループット スクリーニング

ヒト血清アルブミン(HSA)は、糖尿病の初期マーカー蛋白質である。HSAを特異的に認識するモノクローナル抗体に由来する単鎖抗体(single chain Fv, scFv) anti-HSA scFvは、糖尿病の初期診断薬としての利用が期待される有用抗体である。まず、小麦胚芽抽出液を用いた無細胞蛋白質合成系における活性型anti-HSA scFvの発現の効率化について種々の検討を行った。この検討の中で、(1)合成系内では合成産物のC末端が非常に不安定であり、合成直後に分解されること、(2)分解には小麦胚芽中のcarboxypeptidaseが関与していること、(3)carboxipeptidaseの特性、を明らかにし、C末端の分解を防ぐことに成功した。この一連の成果は、原著論文としてJ. Biotechnol. Bioeng.誌に掲載された。次に系内で生産されたanti-HSA scFvの活性化条件について検討した。この結果、(1)scFvの70%以上は可溶性蛋白質として生産される、(2)抗原結合能の増大には、酸化的な条件となるよう翻訳反応終了液を希釈・酸化する必要がある、等の知見が得られた。活性化された単鎖抗体は効率よく抗原分子と結合し、簡便な検出系で検出可能であった。次にフォールディング能向上変異体の取得を目的とした検討を行った。scFv遺伝子全領域にわたってランダム変異を導入し、緑色蛍光蛋白質との融合蛋白質として大腸菌内で発現させ、より強い蛍光シグナルを与えるscFv変異体を取得した。現在、これらの変異体から高い抗原結合能を保持しているものを選び、これらを鋳型として再び変異導入を行い、無細胞蛋白質合成系を用いた迅速発現系により結合速度が増大したクローンを検索している(未発表)。

Youdaoplaceholder0 serum ア ブ ブ ブ ブ ブ (HSA), <s:1> early stage of diabetes <s:1> カ ヒト protein である. HSA を specific に know す る モ ノ ク ロ ー ナ ル antibody に origin す る 単 lock antibodies (single chain Fv, scFv) anti - HSA scFv は, diabetes の early diagnosis 薬 と し て の using が expect さ れ る useful antibodies で あ る. ま ず, wheat germ extract を with い た cell free protein GeChengXi に お け る activity type anti - HSA scFv の 発 の now working rate change に つ い て kind 々 の 検 line for を っ た. Beg の こ の 検 で, (1) GeChengXi で は synthetic product の C terminal が very に unrest で あ り, synthetic straight after the decomposition of に さ れ る こ と, (2) decomposition に は in wheat germ の carboxypeptidase が masato and し て い る こ と, (3) carboxipeptidase の features, を Ming ら か に し, at the end of the C The terminal <s:1> decomposition を prevents ぐ とに とに とに to successfully <s:1> た. The continuous achievements of て, the original paper と, て, J. Biotechnol. Bioeng. The chronicle に reports された. In the に department, で is used to produce されたanti-HSA scFv <s:1> activation conditions に て検 て検 て検 to discuss <s:1> た. こ の results, (1) the scFv の more than 70% soluble protein と は し て production さ れ る, (2) antigen binding energy の raised large に は, acidification な conditions と な る よ う turn 訳 を "at the end of the 応 fluid when 釈, acidification す る necessary が あ る, etc. の know see が ら れ た. The efficacy of the activated された単 lock antibody <e:1> is よく, the antigen molecule と binds to <s:1>, and the な検 exit of the line で検 is possible であった. Then にフォ, にフォ, ディ, ディ, グ can go up to the variable <s:1> to achieve を, と, た検 and を. ScFv heritage 伝 son all areas に わ た っ て ラ ン ダ ム - different を import 蛍 し, green light protein と の fusion protein と し て in coliform で 発 now さ せ, よ り strong い 蛍 light シ グ ナ ル を and え る scFv - variant を obtain し た. Now, こ れ ら の - variant か ら high い antigen binding energy を keep し て い る も の を び, こ れ ら を type where と し て び again - different import を い, cell free protein GeChengXi を with い た rapidly 発 now is に よ り combining speed が raised large し た ク ロ ー ン を 検 cable し て い る (not 発 table).

项目成果

Kawarasaki Y. et al.: "A method for functional mapping of protein protein binding domain by preferential ampllfication of the shortest amplicon using PCR"Analytical Biochemistry. (2002)

Kawarasaki Y. 等人：“通过使用 PCR 优先扩增最短扩增子来绘制蛋白质结合域功能图谱的方法”分析生物化学。

kawarasaki Y. et al.: "Stabilization of affinity-Tagged recombinant protein during/after its production in a cell-free system using wheat-germ"Journal of Bioscience and Bioengineering. (印刷中).

Kawarasaki Y. 等人：“使用小麦胚芽在无细胞系统中生产过程中/之后亲和标记重组蛋白的稳定性”《生物科学与生物工程杂志》（正在出版）。

河原崎泰昌, 中野秀雄, 山根恒夫: "無細胞タンパク質合成系を用いたコンビナトリアルバイオエンジニアリング"生物工学会誌. 79・2. 360-363 (2001)

Yasumasa Kawarazaki、Hideo Nakano、Tsuneo Yamane：“使用无细胞蛋白质合成系统的组合生物工程”日本生物工程学会杂志79・2（2001）。

中野秀雄, 河原崎泰昌, 山根恒夫: "無細胞蛋白質合成系の進歩と応用"現代化学. 370・1. 66-72 (2002)

中野秀夫、河原崎康正、山根恒夫：“无细胞蛋白质合成系统的进展和应用”现代科学370・1（2002）。