海産魚の育種を目指した遺伝子導入技法の開発

海水鱼类基因转移育种技术的开发

• 批准号: 13760140
• 负责人: 吉崎 悟朗
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: 東京水産大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760140/
• 关键词: トランスジェニック; 魚類; GFP; マイクロインジェクション; 育種; 遺伝子導入魚; ニベ; 海産魚

前年度に確立したニベの採卵・採精技術を用いて、外来遺伝子のマイクロインジェクションに用いる受精卵を調整した。受精後の卵を経時的にマイクロインジェクションに供試したところ、受精後10分程度の胚盤が形成された直後の卵から受精後30分程度経過した卵が、卵膜の硬化も進んでおらず、使用しやすいことが明らかとなった。これ以降の受精卵は卵膜が硬化し、弾性に富むため、マイクロピペットを卵内に突き刺すことが困難になった。さらに、この発生段階の受精卵にオワンクラゲに由来する緑色蛍光タンパク質(GFP)のRNAを注入したところ、胞胚中期以降から効率よく翻訳されるようになり、蛍光による外来RNAの発現の確認が可能となった。しかし、孵化仔魚では黒色素胞がGFPと極めて類似した蛍光を発することが明らかとなり、これがGFP発現観察の障害となることも確認された。さらに、メダカのβ-アクチンプロモーターにGFP遺伝子を接続し、さらにその下流にウシ成長ホルモンのポリアデニレーション配列を付加した発見コンストラクトをニベ受精卵に導入したところ、一過性のGFP発現が観察された。また、外来遺伝子の発現開始時期は他の遺伝子導入淡水魚類と同様、胞胚中期遷移以降であることが明らかとなった。以上のように、本研究により分離浮遊卵を産出する典型的な海産魚の卵に外来遺伝子をマイクロインジェクション法で導入し、それを発現する方法の基礎を確立した。今後はマダイやヒラメといった類似した受精卵を産出する水産上有用海産魚類に本法を応用していく予定である。

In the past year, it has been established that the technology of egg collection and sperm collection should be adjusted according to the application of foreign genes. After fertilization, the embryo disc is formed at 10 minutes after fertilization. After fertilization, the embryo membrane is hardened at 30 minutes. The egg membrane of the fertilized egg is hardened, the sex is rich, and the egg is difficult to penetrate. In addition, in the development stage of fertilized eggs, green fluorescent protein (GFP) RNA was injected into the embryo, and in the middle stage of embryo, the expression of foreign RNA was confirmed at a reduced rate. The black pigment cells in the larvae are similar to those in the green pigment cells. In addition, the GFP gene expression was detected in the β-cell culture medium, and the GFP gene expression was detected in the downstream culture medium. The initial stage of the emergence of foreign genes is the introduction of other genes into freshwater fish, and the middle stage of the cytoembryo migration is the descent of foreign genes. In this study, we established the basis for the introduction and discovery of exotic proteins from typical marine fish eggs. In the future, the method will be used to produce fertilized eggs.

项目成果

Boonanuntanasarn, S., Yoshizaki, G. 他3名: "Gene knock-down in rainbow trout embryos using antisense morpholino phosphorodiamidate oligonucleotides"Marine Biotechnology. 4. 256-266 (2002)

Boonaunntanasarn, S.、Yoshizaki, G. 和其他 3 人：“使用反义吗啉代磷酸二酰胺寡核苷酸在虹鳟胚胎中进行基因敲除”海洋生物技术 4. 256-266 (2002)。

Yoshizaki, G. 他4名: "Primordial germ cells : the blueprint for a piscine life"Fish Physiology and Biochemistry. (印刷中). (2003)

Yoshizaki, G. 和其他 4 人：“原始生殖细胞：鱼类生命的蓝图”鱼类生理学和生物化学（印刷中）。

吉崎悟朗: "「動物発生工学」の中の「魚類の遺伝子操作」"朝倉書店(印刷中). (2002)

吉崎五郎：“‘动物发育工程’中的‘鱼类基因操纵’”朝仓书店（出版中）。

吉崎悟朗, 竹内裕, 他2名: "魚類における幹細胞を介した遺伝子導入技法開発の現状"海洋と生物. (印刷中). (2002)

Goro Yoshizaki、Yutaka Takeuchi 等 2 人：“鱼类干细胞介导的基因转移技术的发展现状”《海洋与生物学》（出版中）（2002 年）。