ミオシンのATP加水分解過程のストレイン依存性を一分子で見る

ある種のミオシンでは力発生が2ステップで起こるという知見を追試するとともに、2ステップ目がADPの解離にともなうものであるとの予想を検証するために、蛍光ATPの結合解離と力測定の同時計測を計画した。AOD(音響光学素子)を組み込んで二本の近赤外レーザーオプティカルトラップをつくった。直径1μmのマイクロビーズはEDCとビオチンを介してアビジン化し、オプティカルトラップで操作して、Gアクチンとビオチン化Gアクチンを混合しローダミンファロイジン存在下に重合させたアクチン線維の両端を顕微鏡下にビーズに結合させ伸展して保持した。この操作が困難で実験成功率は低く、Gアクチンとビオチン化Gアクチンの比率を5:1〜15:1まで様々に変えて行ってみた。ビオチン化Gアクチンの比率が低ければ結合しにくく、高くするとビーズ同士の固まりができやすく、結果的に10:1を選択したもののこの条件でも実験操作は困難であった。一方のビーズはキセノンランプにより明視野照明して4分割フォトダイオードに投影し、トラップのスティフネスと移動距離から発生張力を計測すると同時に、フィードバックによって等尺条件に保ちそのときの電流から単位発生張力を測定することができる。1年目はNDフィルターの変更によりトラップ力を変えて力学条件依存性を調べる予定であったが、2年目はフィードバックの程度を可変とする回路により力学条件を変えるシステムにより実験を行うこととした。1nMCy3-EDA-ATPを基質として、緑レーザーの対物レンズ型エバネッセント顕微鏡で一分子観察を行った。ダブルビユーによりアクチンの位置と蛍光の点滅位置が一致していることを確認してVTRに録画した。しかし実際に周囲の蛍光、基盤からの蛍光に由来すると思われる多数の蛍光スポットが明滅しており、力発生と同期した蛍光の変化をとらえることはできなかった。材料としてニワトリ小腸上皮からミオシンIの精製を行い、37℃でin vitro motility assayを行った結果0.14±0.05μm/sの滑り運動が確認できた。カバーグラスにはケミカルエッチングの手法でエバネッセント場を作るための台(横10μm縦1μm高さ1μm)を作成し、ニトロセルロースでコートして、低濃度のミオシン1(0.2μg/ml)を吸着させた。現状では得られた力発生の記録では2ステップが識別できず、この点からも計画していた2ステップ目がADPの解離にともなうものであるかどうかの検討及び、二つのステップの長さの力学条件依存性の検討は行うことができなかった。装置の未完成な部分、非常に困難な手技に対して習熟度が低い点から、さらに条件を検討してこの実験を遂行すべく努力を続けている。

ある種のミオシンでは力発生が2ステップで起こるという知見を追試するとともに、2ステップ目がADPの解離にともなうものであるとの予想を検証するために、蛍光ATPの結合解離と力測定の同時計測を計画した。AOD(音響光学素子)を組み込んで二本の近赤外レーザーオプティカルトラップをつくった。直径1μmのマイクロビーズはEDCとビオチンを介してアビジン化し、オプティカルトラップで操作して、Gアクチンとビオチン化Gアクチンを混合しローダミンファロイジン存在下に重合させたアクチン線維の両端を顕微鏡下にビーズに結合させ伸展して保持した。この操作が困難で実験成功率は低く、Gアクチンとビオチン化Gアクチンの比率を5:1〜15:1まで様々に変えて行ってみた。ビオチン化Gアクチンの比率が低ければ結合しにくく、高くするとビーズ同士の固まりができやすく、結果的に10:1を選択したもののこの条件でも実験操作は困難であった。一方のビーズはキセノンランプにより明視野照明して4分割フォトダイオードに投影し、トラップのスティフネスと移動距離から発生張力を計測すると同時に、フィードバックによって等尺条件に保ちそのときの電流から単位発生張力を測定することができる。1年目はNDフィルターの変更によりトラップ力を変えて力学条件依存性を調べる予定であったが、2年目はフィードバックの程度を可変とする回路により力学条件を変えるシステムにより実験を行うこととした。1nMCy3-EDA-ATPを基質として、緑レーザーの対物レンズ型エバネッセント顕微鏡で一分子観察を行った。ダブルビユーによりアクチンの位置と蛍光の点滅位置が一致していることを確認してVTRに録画した。しかし実際に周囲の蛍光、基盤からの蛍光に由来すると思われる多数の蛍光スポットが明滅しており、力発生と同期した蛍光の変化をとらえることはできなかった。材料としてニワトリ小腸上皮からミオシンIの精製を行い、37℃でin vitro motility assayを行った結果0.14±0.05μm/sの滑り運動が確認できた。カバーグラスにはケミカルエッチングの手法でエバネッセント場を作るための台(横10μm縦1μm高さ1μm)を作成し、ニトロセルロースでコートして、低濃度のミオシン1(0.2μg/ml)を吸着させた。現状では得られた力発生の記録では2ステップが識別できず、この点からも計画していた2ステップ目がADPの解離にともなうものであるかどうかの検討及び、二つのステップの長さの力学条件依存性の検討は行うことができなかった。装置の未完成な部分、非常に困難な手技に対して習熟度が低い点から、さらに条件を検討してこの実験を遂行すべく努力を続けている。