蛍光性ATPアナログを用いた筋収縮中のATP加水分解反応の顕微解析

使用荧光 ATP 类似物对肌肉收缩过程中 ATP 水解反应进行显微分析

• 批准号: 08740655
• 负责人: 白川 伊吹
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Teikyo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08740655/
• 关键词: 蛍光性ATPアナログ; 筋収縮; ATP加水分解

筋収縮はATPの加水分解により放出される化学エネルギーを非常に高い効率で力学エネルギーに変換する過程である。メカノケミカルカップリングの機構はその中心課題であるが、ATPの加水分解反応の直接測定が困難なため力学反応と直接比較することが困難であった。本研究では、蛍光ATPアナログを用いて筋原線維の収縮中のATPの加水分解反応を顕微鏡下に可視化し、ATPase rateを筋収縮と同時に直接的に測定した。1.試料および試薬:ウサギ腸腰筋のグリセリン筋をrigor溶液中でポリトロンにより破砕して筋原線維を得た。蛍光ATPアナログは、ATPのリボースにCy3を導入したCy3-EDA-ATPを用いた。2.ATP加水分解反応及び力学的反応の記録と解析:ガラス微小針を水圧マニピュレーターで操作して1本の筋原線維の両端を保持した。Cy3-EDA-ATPはミオシンに特異的に結合して筋原線維のA帯に蛍光が観察される。蛍光像はSITカメラと画像処理装置をかいしてパソコンに記録した。Caged-ATPをキセノンランプのパルス光により光分解することでATPを急速投与した。Cy3-EDA-ATPに対して過剰のATPが存在することになるので、蛍光ATPが加水分解されて解離した後には無蛍光のATPが結合して、筋原線維の蛍光はATP turnover rateを反映して減衰していく。蛍光強度の減衰を回帰解析して置換速度を得た。等尺性収縮時のATP turnover rateは8度で0.3/sであった。一方のガラス微小針の基部の圧電素子にCaged-ATPの光分解と同時に変位を与えて、筋原線維を様々な速度で等速度短縮させた。置換速度は50%Vmaxで0.7/sまで増加し、それ以上に短縮速度を増すと減少した。上記の実験によりATP加水分解の律速段階の速度が力学的負荷に応じて変化することが直接確認できた。

The chemical process of ATP hydrolysis is very efficient and the mechanical process of ATP hydrolysis is very efficient. The mechanism of ATP hydrolysis is difficult to determine directly. The mechanical reaction is difficult to compare directly. In this study, ATP hydrolysis reaction was visualized under microscope and ATP rate was measured directly. 1. The test material is: it is used for the preparation of the original trace of the tendon in the solution of the tendon. Cy3-EDA-ATP is introduced into the system. 2. ATP hydrolysis reaction and mechanical reaction record and analysis: micro-needle water pressure, operation, 1 original tendon trace dimensional end to maintain Cy3-EDA-ATP is A special binding agent for the A band of the tendon trace. The optical image processing device is used for recording optical images. Caged-ATP can be rapidly released from a single photon. Cy3-EDA-ATP is associated with ATP in the presence of water, ATP in the absence of ATP in the presence of water, ATP in the absence of ATP in the presence of ATP in the presence of water, ATP in the absence of ATP in the presence of water, ATP in the presence of ATP in the presence The attenuation of light intensity is analyzed and the displacement speed is obtained. ATP turnover rate of isosceles contraction is 8 ° 0.3/s. The base of a micro-needle is charged with Caged-ATP photolysis and simultaneous position and velocity shortening. The displacement velocity increases from 50% Vmax to 0.7/s, and the shortening velocity decreases from 50% Vmax to 0.7/s. Note that the speed of ATP hydrolysis is directly confirmed by the mechanical load.

项目成果

白川伊吹: "弾性ひすみが負のクロスブリッジからのヌクレオチド遊離速度" 生物物理. 36巻supplement. S20- (1996)

Ibuki Shirakawa：“负弹性应变下桥的核苷酸释放率”生物物理学第 36 卷增刊。

I.SHIRAKAWA: "Studies of ATP turnover in contracting muscie myofibrils using a fluorescent ATP analog" Journal of muscle research and cell motility. vol 18(未定). (1997)

I.SHIRAKAWA：“使用荧光 ATP 类似物对收缩肌肉肌原纤维的 ATP 周转进行研究”《肌肉研究和细胞运动杂志》第 18 卷（待定）。