EBウイルス特異的治療用アデノウイルスベクターの作製

用于EB病毒特异性治疗的腺病毒载体的生产

• 批准号: 13770152
• 负责人: 黒田 正幸
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Kochi Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13770152/
• 关键词: アデノウイルスベクター; EBウイルス; 遺伝子治療

新規EBV特異的遺伝子治療システムの確立を目指した研究を行い、以下の成果を得た。1.改良アデノウイルスベクター(Adv)の作製EBV陽性腫瘍細胞特にリンパ球系腫瘍への治療用遺伝子ユニット導入効率の上昇、Advへの挿入可能DNAサイズの増加を図るため、従来の5型ベクター(Adv5)のfiber knob遺伝子を35型のものに置換したベクター(Adv5/35f)を作製した。両AdvにGFP遺伝子を組み込み(Adv5/35f-GFP、Adv5-GFP)、様々なEBV陽性ヒト細胞株への比較感染実験を行った結果、ほとんどの細胞で遺伝子導入率がAdv5/35f>Adv5であった。またAdv5/35fは許容挿入DNAサイズも0.8kb大きくできた。2.rtTA発現カセットの挿入方向、駆動プロモーターの選択EBV oriPのFR-DS間介在領域に置換配置したrtTA発現カセット(Tet-on)の挿入方向と駆動プロモーターの違いによる発現量を、Lucレポーター・アッセイにて293細胞で検討した結果、発現カセットはDS→FRの向きに挿入し、かつSV40p駆動性にすることで293packaging細胞内でのrtTA発現leakを抑制でき、挿入DNAサイズもさらに約0.3kb削減が可能となることが示された。以上より、目的の治療用Advの作製が可能になったと考える。今後は、遺伝子の挿入/切り出しが不安定なCre-loxP系に代えて、我々が最近独自に開発した部位特異的組み換え(RES-attP/B)系を利用し、また、組み換え酵素遺伝子とrtTAの発現プロモーターをTREからbi-directional TREに変更して非誘導時のrtTA発現を一層抑制する改良を計画中である。構築した治療用遺伝子ユニットの細胞内環状化と長期維持を確認後、Adv5/35fへ組み込む操作に移る予定である。

The new EBV-specific gene therapy system was established and the following results were obtained. 1. The improved Adv system increases the efficiency of introducing therapeutic genes into EBV positive tumor cells, increases the efficiency of introducing Adv into possible DNA vectors, and controls the substitution of Adv5/35f from Adv5 to Adv 35. Adv GFP gene group (Adv5/35f-GFP, Adv5-GFP), EBV positive cell lines and comparative infection results, Adv5/35f>Adv5 gene introduction rate. Adv5/35f allows insertion of DNA into the genome. 2. rtTA discovery direction, Tet-on direction, Tet-on direction, Tet About 0.3 kb of DNA was inserted into the DNA. The above, the purpose of the treatment with Adv system can be found in the test. In the future, we plan to improve the expression of rtTA by using the newly developed site-specific RES-attP/B system to inhibit the expression of rtTA in TRE bi-directional TRE. After confirming the intracellular cyclization and long-term maintenance of Adv5/35 gene, the operation of Adv5/35 gene was determined.